Association of the gut microbiome and metabolome with the dynamics of laboratory parameters in individuals with type 2 diabetes and obesity after bariatric surgery

Full Text

Введение

В последние годы быстрыми темпами развивается метаболическая (бариатрическая) хирургия как один из методов лечения сахарного диабета 2-го типа (СД 2) [1]. Бариатрические операции обладают высокой эффективностью в снижении массы тела и гликемии [2]. Эти эффекты достигаются за счет множества механизмов, обусловленных техникой операций, таких как уменьшение объема желудка и мальабсорбция. Однако выраженность изменения лабораторных показателей после операции очень индивидуальна, в связи с чем обсуждаются дополнительные механизмы, способные влиять на метаболические параметры после хирургического лечения. Одним из таких факторов является кишечная микробиота [3].

При ожирении наблюдаются снижение микробного генетического богатства [4], композиционные и функциональные изменения микробиоты. К ним в первую очередь относится снижение синтеза определенными типами бактерий короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), что приводит к уменьшению действия инкретинов и увеличению проницаемости кишечной стенки. В этом случае бактерии, бактериальные эндотоксины и токсичные бактериальные продукты жизнедеятельности попадают в кровоток, что способствует состоянию вялотекущего воспаления, дальнейшему увеличению массы тела и повышению риска развития СД 2 [5, 6]. Таким образом, пациенты с ожирением и СД 2 имеют патологический состав кишечной микробиоты, способный предопределить исходы бариатрического вмешательства.

Цель исследования – определить, влияет ли исходный состав кишечной микробиоты на динамику лабораторных показателей у лиц с СД 2 и ожирением после бариатрических вмешательств.

Материалы и методы

Работа проведена в 2020–2022 гг. на базе ФГБУ «НМИЦ эндокринологии».

Критерии включения:

• возраст более 18 лет;
• СД 2;
• индекс массы тела – ИМТ≥35 кг/м²;
• планируемое проведение бариатрической операции – гастрошунтирования;
• подписанное информированное согласие.

Критерии исключения:

• СД 1-го типа и другие специфические типы СД;
• наличие клинической картины острой декомпенсации углеводного обмена (выраженные полиурия и жажда, резкая потеря массы тела, тошнота, рвота, слабость, запах ацетона в выдыхаемом воздухе, симптомы дегидратации и гиповолемии: резкое снижение АД, пониженный тургор кожи, тахикардия);
• острое нарушение мозгового кровообращения, инфаркт миокарда в течение последнего месяца;
• тяжелые сопутствующие заболевания (декомпенсация хронической сердечной недостаточности, хроническая обструктивная болезнь легких, почечная, печеночная недостаточность);
• оперативные вмешательства на тонкой и толстой кишке в анамнезе;
• беременность и лактация;
• онкологические заболевания;
• острые или хронические заболевания органов пищеварения, протекающие с хронической диареей;
• прием лекарственных препаратов: антибиотиков и антибактериальных средств (в том числе невсасывающихся препаратов – рифаксимина, солей висмута и др.), про-, пре-, метабиотиков за месяц до включения в исследования;
• ВИЧ, гепатит В, С.

Дизайн

Соответствующие критериям включения и не имеющие критериев исключения пациенты, методом лечения которых выбрано хирургическое лечение (гастрошунтирование), включались в исследование при условии подписания информированного согласия. В рамках исследования до операции, а также через 6 и 12 мес после нее пациентам проводились клинико-лабораторное обследование, а также сбор кала для последующей оценки состава микробиоты и кишечного метаболома. Всем пациентам после оперативного вмешательства даны рекомендации по приему витаминно-минеральных комплексов.

Обследование пациентов до операции, через 6 и 12 мес после нее включало в себя сбор анамнестических и антропометрических данных, лабораторных показателей, а также анализ кишечной микробиоты.

Сбор образцов стула

Для анализа микробиома и метаболома пациентов в первой временной точке и поиска ассоциаций с клиническими показателями собраны образцы стула, затем заморожены при -80°C.

Пробоподготовка и секвенирование микробиомных образцов

Выделение ДНК из образцов кала проводилось с использованием набора Qiagen Power Fecal PRO в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию вариабельного участка V4 гена 16S рРНК проводили с использованием следующей системы праймеров: модификация 515 F (5´- GTGBCAGCMGCCGCGGTAA - 3´) [7] и Pro-mod-805 R (5´-GACTACNVGGGTMTCTAATCC - 3´) [8]. Второй раунд амплификации проводился с использованием стандартных индексов Illumina с адаптерами. Оба раунда полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводились с использованием ПЦР буфера производства Евроген и амплификатора Bio-Rad CFX-96. Очистку ПЦР-продуктов проводили с помощью набора для выделения ДНК реакционных смесей Cleanup Mini (Евроген). Концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit® (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity Assay Kit. Очищенные ампликоны смешивали эквимолярно в соответствии с полученными концентрациями. Дальнейшая подготовка образца к секвенированию и секвенирование пулированной библиотеки осуществляли с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2 (500 циклов) и прибора MiSeq (Illumina, США) согласно рекомендациям производителя. Первичная обработка (экстракция баркодов) проведена, как описано ранее [9]. После обрезания по баллу качества объединение ДНК-прочтений (ридов) проводилось с помощью пакета SeqPrep; итоговая длина ридов составила 252 пн.

Предобработка микробиомных данных

Данные секвенирования микробиома анализировали с помощью системы Knomics-Biota (https://biota.knomics.ru) [10] с использованием типа проекта «16S dada2 SILVA V4». Проведены: базовая фильтрация и оценка качества данных, профилирование таксономического состава и визуализация. Основные этапы анализа кратко описаны ниже.

Риды отфильтрованы с использованием алгоритма DADA2 [11] для получения ASV (вариантов последовательностей ампликонов). Таксономическая классификация ASV выполнена с использованием классификатора, реализованного в QIIME2 [12, 13] и обученного на базе данных SILVA v.138 [14], предварительно обработанной с использованием RESCRIPt [https://github.com/bokulich-lab/RESCRIPt, Creative Commons Attribution 4.0 License (CC-BY 4.0)]. Последовательности 16S рРНК из базы данных обрезаны в соответствии с использованными праймерами и агрегированы с порогом сходства 99%. Таблицы относительной представленности на уровне видов, родов и т.д. получены путем суммирования значений их ASV. Редкие таксоны (с относительной представленностью <0,5% в >90% образцов) удалены из таблиц представленности.

Статистический анализ микробиомных данных

Статистический анализ выполнен в программе R версии 4.2.2. Полученные таблицы представленности таксонов являются композиционными данными [15], в связи с этим при анализе мы использовали статистические процедуры, учитывающие композиционность.

Ассоциации состава микробиома с клиническими данными оценивались с помощью метода dbRDA (аналог PERMANOVA для непрерывных факторов, функция adonis2 пакета vegan) – с использованием расстояния Эйтчитсона. Предварительно отфильтрованы высококоррелирующие клинические показатели (по одному из каждой пары, для которой коэффициент корреляции Пирсона составил более 0,7). Поправка на множественное сравнение выполнялась методом Бенджамини–Хохберга (отдельно для каждого таксономического уровня). В случае установления значимых различий они интерпретированы с помощью метода ближайшего баланса (пакет NearestBalance, функция nb_lm() [16]. Метод позволяет найти соотношение таксонов (баланс), наиболее сильно связанный с исследуемым показателем. Баланс рассчитывается по формуле:

$B(x_{num},x_{den})=\sqrt{\frac{k_{num}·k_{den}}{k_{num}+k_{den}}}·log\left(\frac{{(\prod _{i=1}^{k_{num}} x_i)}^{\frac{1}{k_{num}}}}{{(\prod _{j=1}^{k_{den}} x_j)}^{\frac{1}{k_{den}}}}\right)$,

где k_num – количество компонент числителя баланса, k_den – количество компонент числителя баланса, x – относительные представленности таксонов: x_i – компоненты числителя баланса, x_j – компоненты знаменателя баланса [17]. Для получения достоверных результатов метод ближайшего баланса запущен 100 раз на 70% образцов, выбранных случайным образом. Таксоны, идентифицированные алгоритмом более чем в 90% итераций, считались достоверно ассоциированными с клиническими данными. Для анализа относительного вклада каждого элемента баланса также выполнен анализ для представленностей таксонов после clr-преобразования с помощью линейной модели. Clr-преобразование осуществлялось после замены всех нулей в таблицах представленности (каунтов) на псевдоотсчет (0.5).

Понижение размерности микробиомных данных для поиска корреляций с метаболомом проведено путем поиска кластеров сопредставленных микробных родов алгоритмом SPIEC-EASI [18] с методом Meinshausen–Bühlmann для обнаружения корреляций (другие параметры: количество подвыборок – 50, количество итераций лямбда – 10, минимальное значение лямбда – 0.2). Кластеры сопредставленных родов определены с помощью метода Лувиана [19]. Для анализа в композиционном ключе для каждого кластера строился баланс, включающий в числителе все таксоны из конкретного кластера, а в знаменателе – все остальные таксоны.

Пробоподготовка образцов метаболома

Для экстрагирования метаболитов к 20 мкг образца добавляли 500 мкл экстрагирующей смеси (ацетонитрил: изопропанол:вода, 3:3:2, объемные доли), центрифугировали, декантировали и высушивали досуха в центрифужном испарителе. Далее проводили повторную экстракцию, добавляя к сухому остатку 500 мкл смеси ацетонитрил: вода (1:1, объемные доли), после чего повторяли процедуры центрифугирования и высушивания надосадочной жидкости.

Чтобы избежать артефактов на хроматограммах (например, в результате кето-енольной таутомеризации, циклизации сахаров и декарбоксилирования α-кето кислот), проведена метоксимация. К каждому высушенному досуха образцу добавляли 10 мкл раствора MeOX в пиридине (20 мг/мл) и далее перемешивали в термошейкере (90 мин, 30°C).

В качестве внутренних стандартов использовали смесь метиловых эфиров жирных кислот. К каждому образцу после метоксимации добавляли 91 мкл смеси FAME/MSTFA. Смесь получали добавлением 1 мкл MSTFA к 10 мкл FAME. После добавления силилирующего агента и внутреннего стандарта к исследуемым образцам пробирки с реакционной смесью перемешивали в термошейкере (30 мин, 37°C), переносили в инактивированные стеклянные вставки и направляли на хромато-масс-спектрометрический анализ.

Оценка метаболома с помощью хромато-масс-спектрометрического профилирования

Для метаболомного профилирования использован прибор LECO Pegasus BT-4D. Конфигурация прибора включает двумерный газовый хроматограф Agilent 7890B, времяпролетный масс-спектрометр субноминального разрешения и магистральный пробоотборник L-PAL3. Двумерная хроматография подразумевает сочетание двух хроматографических колонок разной селективности, за счет чего многократно возрастает пиковая емкость системы и улучшается разделение компонентов. В рамках данного эксперимента использована комбинация низкополярной (Rxi-5MS, длина – 29,69 м, внутренний диаметр – 250 мкм, Restek) и среднеполярной (Rxi-17Sil MS, длина – 1,95 м, внутренний диаметр – 250 мкм, Restek) колонок.

Хромато-масс-спектрометр управлялся с помощью ПО ChromaTOF (v.5.51.06.0.64572). Перед экспериментом проведены процедура калибровки с помощью стандарта перфтортрибутиламина (PFTBA, FC43) и тесты на отсутствие течей разного рода (leak check).

Эксперимент проводился в двух технических повторениях для каждого образца. Образец (1 мкл) подавался в хроматограф через нагретый до 250°C инжектор в split-режиме (на 100 частей He 99,9999% подается 1 часть образца). Стартовая температура в хроматографической печи составляла 60°C и поддерживалась в течение минуты, далее начинался температурный градиент (10°C/мин, 12 мин). Период модуляции составлял 4 с (горячий пульс – 1,2 с, холодный пульс – 0,8 с).

Температура трансферной линии между газовым хроматографом и масс-спектрометром поддерживалась на уровне 280°C. Ионизацию элюирующих соединений осуществляли методом электронного удара (EI, 70 eV). Масс-спектры (200 спектров в секунду) регистрировали в диапазоне массово-зарядных чисел m/z от 35 до 700. Выдержана 350-секундная отсрочка в записи GC×GC-MS файла для выхода неинформативных соединений (силилирующие агенты, пиридин) из хроматографической колонки.

Всего выполнены 36 технических повторений хромато-масс-спектрометрического эксперимента, а также серия холостых экспериментов.

Обработка сырых данных хромато-масс-спектрометрического профилирования

Полученные хромато-масс-спектрометрические данные обработаны (обнаружение и выравнивание пиков) в программе ChromaTOF (LECO). Времена удерживания, величины m/z и интегрированные площади пиков скорректированы. Метаболиты идентифицированы на основе их масс-спектров и времени удерживания с использованием библиотек Национального института стандартов и технологий (NIST), библиотек Mainlib и Feihn, а также открытого репозитория PubChem в Национальном институте здравоохранения США. Для дальнейшей интерпретации выбирали идентификации с показателями similarity более 700 (т.е. те, времена удержания и спектры электронной ионизации которых надежно согласовывались с библиотечными данными). Для каждого образца сформирован список метаболитов, обнаруженных в обеих технических повторностях. Отфильтрованы соединения, которые априори не имеют отношения к биологическим процессам (например, разнообразные силоксаны, являющиеся компонентами хроматографической колонки). Идентифицированные соединения соотнесены с базой данных метаболома человека (HMDB, https://hmdb.ca/).

Предобработка метаболомных данных

Для каждого вещества, соотнесенного с базой HMDB, значения площади пика переведены в значения концентраций с использованием информации о площади пиков стандарта (метилового эфира додекановой кислоты) в каждом запуске. Значения концентраций усреднены между техническими повторностями. Для соединений соотнесенных с одним метаболитом из HMDB концентрации суммированы.

Редкие метаболиты, детектированные менее чем в 3 образцах, исключены из анализа. Также исключены метаболиты, которые встречались только в образцах, собранных в 2021 г. или только в 2022–2023 гг. После фильтрации нулевые значения заменены на псевдоотсчеты, соответствующие минимальной концентрации по всем метаболитам всех образцов, деленной на 2. Далее значения концентраций трансформированы с помощью clr-преобразования. Параллельно мы выполнили такие альтернативные трансформации, как центрирование, автошкалирование, однако результаты различались незначительно.

Статистический анализ метаболомных данных

Анализ ассоциаций метаболома с клиническими данными выполнен для сокращенного списка показателей ввиду малого количества образцов. Для данных анализов выбраны только показатели, значимо ассоциированные с составом и динамикой микробиома. Анализ ассоциаций выполнен таким же образом, как для состава микробиома.

Понижение размерности метаболомных данных для поиска корреляций с микробиомом проведено путем поиска кластеров метаболитов при помощи алгоритма WGCNA [20]. Путем построения графика сравнения топологии с безмасштабной сетью выбрана степень 4. Полученные с помощью WGCNA собственные значения для каждого модуля соединений использовались в дальнейшем анализе для поиска корреляций кластеров с микробиомом. Для характеристики модулей проанализировали обогащение в них метаболических путей. Для этого идентификаторы метаболитов в HMDB переведены в идентификаторы соединений по базе KEGG, принадлежность соединений метаболическим путям установлена с использованием функции keggLink (пакет KEGGREST). Значимо обогащенные пути идентифицированы при помощи гипергеометрического теста, в качестве фона (background) использовались все соединения, найденные в анализируемых образцах.

Поиск ассоциаций между метаболомом и составом микробиома в первой временной точке

Корреляция между составом микробиоты и метаболомом в целом проанализирована с помощью теста Мантела с расстояниями Эйтчисона. Также мы проанализировали корреляции представленности кластеров совстречающихся микроорганизмов и собственных значений модулей метаболитов с помощью линейной модели. Поправка на множественное сравнение выполнялась методом Бенджамини–Хохберга.

Результаты и обсуждение

Оперативное вмешательство проведено у 48 пациентов, контрольное обследование через 6 и 12 мес – у 37 и 36 пациентов соответственно. В табл. 1 представлены исходные характеристики пациентов, а также динамика показателей после хирургического лечения.

 

Таблица 1. Динамика антропометрических и лабораторных параметров в контрольных точках исследования

Table 1. Change of antropometric and laboratory parameters at study visits

Показатель	До операции (n=48)	6 мес (n=37)	12 мес (n=36)	Р (Friedman ANOVA)
ИМТ, кг/м2	48,4 [43, 0; 52, 0]	35,5 [31, 6; 38, 5]	31,9 [28, 0; 34, 6]	0,000001
Масса тела, кг	136,5 [120, 5; 150, 2]	96,0 [82, 3; 115, 8]	87,0 [76, 8; 103, 0]	0,000001
HbA1c, %	6,9 [6, 3; 7, 9]	5,5 [5, 1; 5, 8]	5,6 [5, 2; 5, 9]	0,000001
Глюкоза натощак, ммоль/л	6,7 [5, 7; 8, 8]	5,4 [4, 8; 5, 9]	5,2 [4, 6; 5, 8]	0,0015
Креатинин, мкмоль/л	70,5 [63, 5; 84, 2]	65,6 [59, 5; 69, 4]	62,4 [57, 5; 68, 7]	0,00061
Общий холестерин, ммоль/л	4,99 [4, 17; 5, 81]	3,93 [3, 3; 4, 47]	4 [3, 4; 4, 62]	0,000001
Холестерин ЛНП, ммоль/л	3,0 [2, 33; 3, 7]	2,28 [1, 69; 2, 83]	2,26 [1, 8; 2, 8]	0,000001
Триглицериды, ммоль/л	2,23 [1, 86; 3, 05]	1,25 [1, 04; 1, 5]	1,0 [0, 87; 1, 2]	0,000001
Кальций/альбумин, ммоль/л	2,3 [2, 26; 2, 38]	2,26 [2, 22; 2, 32]	2,21 [2, 15; 2, 28]	0,00057
С-пептид, нг/мл	4,85 [3, 81; 6, 02]	2,83 [2, 05; 3, 58]	2,63 [2, 0; 3, 19]	0,00002
НОМА-IR	8,33 [4, 85; 12, 96]	2,0 [1, 5; 3, 2]	1,9 [1, 34; 2, 62]	0,000001
25(ОН) витамин D, пг/мл	17,6 [10, 2; 24, 8]	26,0 [15, 5; 41, 3]	29,75 [25, 0; 40, 73]	0,00008
ПТГ, пг/мл	40,96 [28, 3; 57]	47,2 [35, 26; 58, 4]	47,1 [37, 4; 60, 6]	0,18469

Примечание. HbA_1c – гликированный гемоглобин, ПТГ – паратиреоидный гормон.

Note. HbA_1c – glycated haemoglobin, ПТГ – parathyroid hormone.

 

Как следует из табл. 1, в ходе оперативного вмешательства отмечалось значимое снижение массы тела, что сопровождалось улучшением показателей гликемии, липидного спектра, снижением инсулинорезистентности. К 12 мес после операции у пациентов регистрировались низкий уровень общего кальция (с поправкой на альбумин), нецелевое значение уровня 25(ОН) витамина D. Отмечалась тенденция к увеличению уровня паратиреоидного гормона (ПТГ), не достигшая статистической значимости.

Если положительные метаболические характеристики оперативного вмешательства являются его ожидаемым эффектом, то влияние на метаболизм кальция и 25(ОН) витамин D напрямую зависят от приверженности пациентов приему витаминно-минеральных комплексов. Согласно текущим рекомендациям после бариатрических операций (особенно с шунтирующим компонентом) требуется на постоянной основе восполнение дефицита витаминов, микро- и макронутриентов под контролем лабораторных показателей [21]. Однако по результатам исследований у многих пациентов еще до хирургического лечения может отмечаться дефицит 25(ОН) витамина D и вторичный гиперпаратиреоз, которые усиливаются в случае несоблюдения пациентом рекомендаций по приему заместительной витаминной терапии [22]. В целом долгосрочная приверженность витаминно-минеральной поддержке после бариатрических операций остается низкой [23].

Ассоциации между составом микробиома и динамикой метаболических и антропометрических показателей

В ходе исследования проанализировано, имеется ли зависимость между составом микробиома в исходной точке и изменениями лабораторных показателей по прошествии 6 и 12 мес после вмешательства. Для этого для каждого из анализируемых показателей рассчитана дельта между значениями в 6 мес и исходными значениями, а также в 12 мес и исходными значениями. Для поиска ассоциаций данных разностей с исходным составом микробиома использовался метод dbRDA с поправкой на год сбора образца после удаления аутлаеров по значениям анализируемых показателей. Установлено, что исходный состав микробиома на уровнях вида, рода, семейства и порядка значимо влиял на изменения ПТГ и на уровне порядка – 25(ОН) витамина D через 12 мес после вмешательства, а также на уровень общего холестерина и креатинина через 6 мес после вмешательства (FDR<0,05); табл. 2.

 

Таблица 2. Значимые ассоциации между исходным составом микробиоты и изменением метаболических показателей через 6 и 12 мес после вмешательства

Table 2. Significant associations between the baseline composition of the microbiota and the change in metabolic parameters at 6 and 12 months after the intervention

Показатель	Таксономический уровень	Количество образцов	Уровень значимости (р)	Уровень значимости после поправки (FDR)	Размер эффекта R2	Временной промежуток, мес
Общий холестерин	Фил	22	0,0042	0,0126	15,3	6
Креатинин	Фил	25	0,0007	0,0378	17,3	6
ПТГ	Вид	22	0,0064	0,001	13,7	12
ПТГ	Род	22	0,0064	0,010	13,1	12
ПТГ	Семейство	22	0,0112	0,010	14,0	12
25(ОН) витамин D	Порядок	23	0,0328	0,0472	12,7	12
ПТГ	Порядок	22	0,0328	0,0472	12.,8	12

 

Уровни креатинина и общего холестерина за время наблюдения снизились сильнее у людей с изначально большей представленностью Fusobacteriota и Bacteroidota в микробиоме. Для ПТГ более выраженные изменения показателей ассоциированы с повышенной начальной представленностью неклассифицированных Fusobacterium, (микроб, характерный для ротовой полости); рис. 1. Наиболее типичный представитель Fusobacterium в организме человека, Fusobacterium nucleatum, играет роль в развитии колоректального рака [24], в том числе путем производства сероводорода – H₂S [25, 26]. Порядок Christensenellales ассоциирован с более выраженным ростом уровня 25(ОН) витамина D и менее выраженным ростом ПТГ (см. рис. 1). Для представителя данного порядка Christensenella ранее показана связь с нормальным ИМТ [27]. При этом порядок Verrucomicrobiales отрицательно ассоциирован с увеличением 25(ОН) витамина D. Наиболее распространенный представитель данного порядка в кишечном микробиоме – Akkermansia muciniphila – также ассоциирована с благоприятными метаболическими показателями, в частности с нормальным ИМТ [28], и известна своей способностью питаться муцином.

 

Рис. 1. Балансы таксонов, ассоциированные с изменениями метаболических показателей через 12 мес после операции: а – ПТГ; b – 25(ОН) витамин D. Голубой цвет означает элементы числителя баланса (положительно ассоциированные таксоны), а красный – знаменателя (отрицательно ассоциированные таксоны). Интенсивность цвета пропорциональна воспроизводимости таксона. Справа показана зависимость между значением баланса и динамикой показателя.

Fig. 1. Taxonal balances associated with changes in metabolic parameters 12 months after surgery: a – PTH; b – 25(OH)vitamin D. Blue represents the elements of the balance numerator (positively associated taxa) and red represents the elements of the balance denominator (negatively associated taxa). The color intensity is proportional to the taxon reproducibility. The relationship between the balance value and the change of the indicator is shown on the right.

 

Ассоциации между составом микробиома и метаболическими показателями в первой временной точке

Мы исследовали, имеются ли ассоциации между составом микробиома и собранными метаданными в первой временной точке (N=40 образцов). Значимые ассоциации методом dbRDA получены для общего холестерина (на уровне класса) и С-пептида (на уровне класса; FDR<0,05); табл. 3.

 

Таблица 3. Значимые ассоциации между составом микробиоты и метаболическими показателями в первой временной точке

Table 3. Significant associations between the microbiota composition and metabolic parameters at the first time point

Показатель	Таксономический уровень	Количество образцов	Уровень значимости p	Уровень значимости после поправки (FDR)	Размер эффекта R2
Общий холестерин	Класс	40	0,0042	0,0442	8,1
С-пептид	Класс	40	0,0052	0,0442	7,6

 

Уровень общего холестерина отрицательно ассоциирован с представленностью Actinobacteria. Наиболее типичные представители данного класса – Bifidobacteriaceae и Coriobacteriaceae – являются нормофлорой кишечника человека, ассоциированы со здоровым состоянием организма хозяина и посредством кросс-фидинга участвуют в производстве масляной кислоты [29]. В то же время наблюдалась положительная ассоциация уровня общего холестерина с классом Fusobacteriia, включающим производителей H₂S.

Уровень С-пептида положительно ассоциирован с классом, включающим других широко распространенных в кишечнике производителей H₂S – Desulfovibrionia.

Результаты анализа метаболомных данных

Ассоциации между метаболизмом и метаболическими показателями в первой временной точке

Ввиду того, что количество образцов (N=11), для которых получен метаболом, оказалось ниже количества образцов, для которых проводилось секвенирование микробиома, мы проанализировали связь метаболома и метаданных в первой временной точке только для факторов, значимо ассоциированных с составом микробиома, а именно с общим холестерином и С-пептидом. Значимых ассоциаций для данных факторов не обнаружено (p>0,05; N=10 образцов).

Сравнение состава микробиома и метаболома образцов

Согласно тесту Мантела расстояния между образцами, полученные с использованием информации о составе микробиома и о метаболоме, значимо коррелировали в первой временной точке (p=0,0208).

Ввиду того, что и метаболомные, и микробиомные данные характеризуются высокой размерностью, мы исследовали корреляции между компонентами данных после операций уменьшения размерности. Для уменьшения размерности микробиомных данных использовали метод поиска сопредставленных групп бактерий SPIEC-EASI, а для метаболомных данных – модулей метаболитов с помощью алгоритма WGCNA. Обнаружено 7 групп сопредставленных бактерий (рис. 2) и 8 модулей сопредставленных метаболитов (рис. 3). Для кластеризации мы использовали все образцы, имеющиеся для каждого из анализов. Для интерпретации модулей метаболитов проанализировано обогащение в них метаболических путей. Значимое обогащение наблюдалось в модуле M2 (пути биосинтеза фенилпропаноидов – ko01061, биосинтеза алкалоидов, полученных из шикиматного пути – ko01063, цикла цитрата – TCA ko00020, биосинтеза алкалоидов, полученных из гистидина и пурина – ko01065, центрального углеродного обмена при раке – ko05230 и биосинтеза терпеноидов и стероидов – ko01062), а также в модуле M4 (биосинтез ненасыщенных жирных кислот – ko01040).

 

Рис. 2. Кластеры совстречающихся микроорганизмов. Цветом обозначены найденные кластеры. Размеры кругов пропорциональны средней представленности таксонов. Серые линии соединяют таксоны, корреляции между которыми детектированы при помощи алгоритма SPIEC-EASI.

Fig. 2. Clusters of coinciding microorganisms. The color indicates the found clusters. The sizes of the circles are proportional to the mean abundance of the taxa. Gray lines connect taxa with correlations detected using the SPIEC-EASI algorithm.

 

Рис. 3. Модули совстречающихся метаболитов, определенные при помощи алгоритма WGCNA. Цветом обозначены найденные кластеры. Серым цветом обозначены некластеризованные метаболиты.

Fig. 3. Modules of concurrent metabolites determined using the WGCNA algorithm. The color indicates the found clusters. Gray indicates non-clustered metabolites.

 

После получения кластеров и модулей мы проассоциировали их между собой с использованием линейной модели в первой временной точке. Найдено несколько значимых зависимостей (FDR<0,05). Установлено, что модуль M4, в котором обогащен путь биосинтеза ненасыщенных жирных кислот, положительно коррелирует с кластерами микроорганизмов, в которых доминируют Dialister и Enterococcus (коричневый; см. рис. 2), а также кластером, где доминирует Blautia (зеленый). При этом отрицательно – с кластером, где доминируют [Ruminococcus]_torques_group и Oscillospiraceae-UCG-002 (желтый). Модуль М2, в котором обогащен ряд путей, в том числе синтеза алкалоидов, положительно коррелировал с кластером микроорганизмов, в котором доминируют Christensenellaceae_R-7_group, Roseburia и Subdoligranulum (синий). Кластер, где доминируют Dialister и Enterococcus (коричневый), также отрицательно коррелировал с модулем М5, для которого не нашлось значимо обогащенных путей. Его составили 12 метаболитов (табл. 4). Кластер, где доминирует микроорганизм RF39, коррелировал положительно с модулем МЕ6, для которого также не найдено значимо обогащенных путей (см. табл. 4).

 

Таблица 4. Метаболиты, вошедшие в модули, значимо ассоциированные с микробиомом

Table 4. Metabolites included in modules significantly associated with the microbiome

Модуль	Метаболиты	Кластер бактерий	Направление ассоциации
ME2	Cellobiose; Fumaric acid; Malic acid; Phenylalanine; L-Threonine; Histidine; myo-Inositol; Succinic acid; Pyroglutamic acid; Urocanic acid; 2-Hydroxy-3-methylbutyric acid; L-Cysteine; Citrulline; Hydroxyphenyllactic acid; L-Valine; 1-Hexadecanol; p-Synephrine; MG(18:0/0:0/0:0)	Subdoligranulum; Roseburia; Christensenellaceae_R-7_group; Barnesiella; Marvinbryantia; Oscillospiraceae-UCG-005	+
ME4	Oleic acid; 3-(3-Hydroxyphenyl)propanoic acid; Caprylic acid; Linoleic acid; 4-Hydroxycyclohexylcarboxylic acid; 11Z-Eicosenoic acid; Nervonic acid; Diethanolamine; Alanylglycine; 5,8,11-Eicosatrienoic acid; Palmitelaidic acid; Norvaline; Ricinoleic acid	Ramboustia, Dialister, Veillonella, Enterococcus	+
		[Eubacterium]_hallii_group Eggerthellaceae; Blautia; Erysipelotrichaceae_UCG-003; Senegalimassilia; Collinsella; Dorea	+
		Catenibacterium; Paraprevotella; [Ruminococcus]_torques_group; Oscillospiraceae-UCG-002; Butyricicoccus; Parasutterella; Agathobacter; NK4A214_group	-
ME5	Epinephrine; Glycerol; Indoleacetic acid; Palmitic acid; Urea; 5-Hydroxy-L-tryptophan; Malonic acid; Valeric acid; 2-Pyrrolidinone; Cadaverine; (2R*,3R*)-1,2,3-Butanetriol; 1-Deoxy-D-ribitol	Ramboustia, Dialister,Veillonella, Enterococcus	-
ME6	p-Hydroxyphenylacetic acid; Pipecolic acid; gamma-Aminobutyric acid; L-Alanine; D-Maltose; Inosine; Sphingosine; 3-Amino-2-piperidone; Gluconic acid; Ketoleucine; L-Tryptophan; 1,3-Butanediol	Bacilli RF39; Clostridia_UCG-014	+

 

Заключение

Данное исследование посвящено выявлению взаимосвязи между кишечным микробиомом и динамикой лабораторных показателей у лиц с СД 2 после бариатрических вмешательств. По результатам исследования у пациентов наряду с уменьшением массы тела отмечалось снижение гликемии, уровня холестерина липопротеидов низкой плотности, уровня триглицеридов. Показателями, динамика которых связана с исходным кишечным микробиомом, оказались уровень общего холестерина, креатинин, 25(ОН) витамин D, ПТГ. Полученная взаимосвязь требует аккуратной интерпретации в силу малой выборки. При подтверждении результатов в последующих исследованиях состав микробиома может потенциально использоваться для предварительной оценки эффективности бариатрического вмешательства.

Раскрытие конфликта интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Е.А. Шестакова – методология, формальный анализ, написание – первоначальный вариант; Н.С. Клименко – программное обеспечение, написание – первоначальный вариант; Е.В. Покровская – методология, курация данных, исследование, написание – первоначальный вариант; М.С. Синеокая – исследование, написание – рецензирование и редактирование; С.И. Кошечкин – методология, написание – рецензирование и редактирование; В.Е. Одинцова – валидация, написание – рецензирование и редактирование; М.В. Шестакова – разработка концепции исследования, методология, написание – рецензирование и редактирование.

Authors' contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. E.A. Shestakova – methodology, formal analysis, writing – original draft; N.S. Klimenko – software, writing – original draft; E.V. Pokrovskaya – methodology, data curation, investigation, writing – original draft; M.S. Sineokaya – investigation, writing – review & editing; S.I. Koshechkin – methodology, writing – review & editing; V.E. Odintsova – validation, writing – review & editing; M.V. Shestakova – conceptualization, methodology, writing – review & editing.

Раскрытие информации об использовании ИИ. При написании статьи ИИ не использовался.

Disclosing the use of AI. No AI was used when writing the article.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

Источник финансирования. Исследование проведено в рамках выполнения Государственного задания Минздрава России (НИОКР №123021300168-7).

Funding source. The study was supported by the Governmental Task of the Ministry of Health of Russia (No. 123021300168-7).

Соответствие принципам этики. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» (№1 от 22.01.2020). Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской декларации.

Compliance with the principles of ethics. The study protocol was approved by the local ethics committee of Endocrinology Research Center (Minutes No. 1 dated 22.01.2020). Approval and protocol procedure was obtained according to the principles of the Declaration of Helsinki.

About the authors

Ekaterina A. Shestakova

Endocrinology Research Centre, Moscow

Author for correspondence.
Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6612-6851

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Natalia S. Klimenko

Nobias Technologies LLC

Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9640-0102

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Elena V. Pokrovskaya

Endocrinology Research Centre, Moscow

Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5268-430X

Res. Officer

Russian Federation, Moscow

Maria S. Sineokaya

Endocrinology Research Centre, Moscow

Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-7343-687X

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Stanislav I. Koshechkin

Nobias Technologies LLC

Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7389-0476

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Vera E. Odintsova

Nobias Technologies LLC

Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1897-4033

chief bioinformatician

Russian Federation, Moscow

Marina V. Shestakova

Endocrinology Research Centre, Moscow

Email: katiashestakova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5057-127X

D. Sci. (Med.), Prof., Acad. RAS

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files