Дизайн термостабильного мини-интеина для интеин-опосредованного выделения рекомбинантных белков и пептидов

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Данное исследование посвящено разработке термостабильных и термоактивируемых мини-интеинов на основе полноразмерного интеина DnaE1 из Thermus thermophilus HB27. В результате проведённого рационального дизайна на основе полноразмерного интеина путём внесения делеций были сконструированы мини-интеины TthDnaE1 Δ272, Δ280 и Δ287. Высокую эффективность сплайсинга наблюдали для TthDnaE1 Δ272 и Δ280 при температурах выше 50 °С. Наиболее активный мини-интеин с делецией Δ280 выбрали в качестве основы для создания самоотщепляющегося носителя аффинных меток путём точечного мутагенеза. Осуществлены мутации C1A, D405G и C1A/D405G, направленные на устранение возможности отщепления N-концевого экстеина и лигирования экстеинов. В результате максимальную эффективность отщепления C-экстеина наблюдали при температуре 60 °С у мини-интеина Δ280 с двойной мутацией C1A/D405G. Таким образом, нами были сконструированы термостабильные и термоактивируемые мини-интеины, способные к эффективному белковому сплайсингу или отщеплению C-концевого экстеина. Созданный мини-интеин TthDnaE1 Δ280 С1A/D405G может служить основой для разработки новой экспрессионной системы, предназначенной для интеин-опосредованного получения рекомбинантных белков и пептидов медицинского назначения.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. А. Каранов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: andrey-karanov2000@mail.ru

факультет биоинженерии и биоинформатики

Россия, 117997 Москва; 119234 Москва

Е. А. Заяц

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: refolding@mail.ru
Россия, 117997 Москва

М. А. Костромина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: refolding@mail.ru
Россия, 117997 Москва

Ю. А. Абрамчик

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: refolding@mail.ru
Россия, 117997 Москва

А. Р. Шарафутдинова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: refolding@mail.ru
Россия, 117997 Москва

М. С. Суркова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Email: refolding@mail.ru
Россия, 117997 Москва

А. А. Замятнин

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: refolding@mail.ru

факультет биоинженерии и биоинформатики

Россия, 119234 Москва

Р. С. Есипов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: refolding@mail.ru

факультет биоинженерии и биоинформатики

Россия, 117997 Москва; 119234 Москва

Список литературы

  1. Ben-Bassat, A. (1991) Purification and Analysis of Recombinant Proteins (Seetharam, R., and Sharma, S. K., eds), Marcel Dekker, N.Y., pp. 147-151.
  2. Enfors, S. O. (1992) Control of in vivo proteolysis in the production of recombinant proteins, Trends Biotechnol, 10, 310-315, https://doi.org/10.1016/0167-7799(92)90256-u.
  3. Mahmoodi, S., Pourhassan-Moghaddam, M., Wood, D. W., Majdi, H., and Zarghami, N. (2019) Current affinity approaches for purification of recombinant proteins, Cogent Biol., 5, 1665406, https://doi.org/10.1080/ 23312025.2019.1665406.
  4. Eskandari, A., Leow, T. C., Rahman, M. B. A., and Oslan, S. N. (2024) Utilization and prospect of purification technologies in natural proteins, peptides and recombinant proteins, J. Proteins Proteom., 15, 233-257, https://doi.org/10.1007/s42485-024-00139-7.
  5. Esipov, R. S., Stepanenko, V. N., Chupova, L. A., Boyarskikh, U. A., Filipenko, M. L., and Miroshnikov, A. I. (2008) Production of recombinant human epidermal growth factor using Ssp dnaB mini-intein system, Protein Expr. Purif., 61, 1-6, https://doi.org/10.1016/j.pep.2008.05.009.
  6. Volkmann, G., and Mootz, H. D. (2013) Recent progress in intein research: from mechanism to directed evolution and applications, Cell Mol. Life Sci., 70, 1185-1206, https://doi.org/10.1007/s00018-012-1120-4.
  7. Yuan, H., Prabhala, S. V., Coolbaugh, M. J., Stimple, S. D., and Wood, D. W. (2024) Improved self-cleaving precipitation tags for efficient column free bioseparations, Protein Expr. Purif., 224, 106578, https://doi.org/10.1016/ j.pep.2024.106578.
  8. Lahiry, A., Fan, Y., Stimple, S. D., Raith, M., and Wood, D. W. (2018) Inteins as tools for tagless and traceless protein purification, J. Chem. Technol. Biotechnol., 93, 1827-1835, https://doi.org/10.1002/jctb.5415.
  9. Cui, C., Zhao, W., Chen, J., Wang, J., and Li, Q. (2006) Elimination of in vivo cleavage between target protein and intein in the intein-mediated protein purification systems, Protein Expr. Purif., 50, 74-81, https://doi.org/10.1016/ j.pep.2006.05.019.
  10. Hiraga, K., Derbyshire, V., Dansereau, J. T., Van Roey, P., and Belfort, M. (2005) Minimization and stabilization of the Mycobacterium tuberculosis recA intein, J. Mol. Biol., 354, 916-926, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2005.09.088.
  11. Esipov, R. S., Beirakhova, K. A., Chupova, L. A., Likhvantseva, V. G., Stepanova, E. V., and Miroshnokov, A. I. (2012) Recombinant fragment of pigment epithelium-derived factor (44-77) prevents pathological corneal neovascularization, Bioorg. Khim., 38, 1-8.
  12. Shen, B., Sun, X., Zuo, X., Shilling, T., Apgar, J., Ross, M., Bougri, O., Samoylov, V., Parker, M., Hancock, E., Lucero, H., Gray, B., Ekborg, N. A., Zhang, D., Johnson, J. C. S., Lazar, G., and Raab, R. M. (2012) Engineering a thermoregulated intein-modified xylanase into maize for consolidated lignocellulosic biomass processing, Nat. Biotechnol., 30, 1131-1136, e2402, https://doi.org/10.1038/nbt.2402.
  13. Wang, Y., Shi, Y., Hellinga, H. W., and Beese, L. S. (2023) Thermally controlled intein splicing of engineered DNA polymerases provides a robust and generalizable solution for accurate and sensitive molecular diagnostics, Nucleic Acids Res., 51, 5883-5894, https://doi.org/10.1093/nar/gkad368.
  14. Yan, S.-S., Yan, J., Shi, G., Xu, Q., Chen, S.-C., and Tian, Y.-W. (2005) Production of native protein by using Synechocystis sp. PCC6803 DnaB mini-intein in Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 40, 340-345, https://doi.org/10.1016/ j.pep.2004.12.021.
  15. Wu, H., Xu, M.-Q., and Liu, X.-Q. (1998) Protein trans-splicing and functional mini-inteins of a cyanobacterial dnaB intein, Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-432, https://doi.org/10.1016/s0167-4838(98)00157-5.
  16. Malone, C. L., Boles, B. R., and Horswill, A. R. (2007) Biosynthesis of Staphylococcus aureus autoinducing peptides by using the Synechocystis DnaB mini-intein, Appl. Environ. Microbiol., 73, 6036-6044, https://doi.org/10.1128/AEM.00912-07.
  17. Tian, L., and Sun, S. S. (2011) A cost-effective ELP-intein coupling system for recombinant protein purification from plant production platform, PLoS One, 6, e24183, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024183.
  18. Gangopadhhyay, J. P., Jiang, S.-Q., van Berkel, P., and Paulus, H. (2003) In vitro splicing of erythropoietin by the Mycobacterium tuberculosis RecA intein without substituting amino acids at the splice junctions, Biochim. Biophys. Acta, 1619, 193-200, https://doi.org/10.1016/s0304-4165(02)00495-6.
  19. Banki, M. R., Feng, L., and Wood, D. W. (2005) Simple bioseparations using self-cleaving elastin-like polypeptide tags, Nat. Methods, 2, 659-661, https://doi.org/10.1038/nmeth787.
  20. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, https://doi.org/10.1016/ 0003-2697(76)90527-3.
  21. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.
  22. Schägger, H., and von Jagow, G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa, Anal. Biochem., 166, 368-379, https://doi.org/10.1016/ 0003-2697(87)90587-2.
  23. Van Roey, P., Pereira, B., Li, Z., Hiraga, K., Belfort, M., and Derbyshire, V. (2007) Crystallographic and mutational studies of Mycobacterium tuberculosis recA mini-inteins suggest a pivotal role for a highly conserved aspartate residue, J. Mol. Biol., 367, 162-173, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2006.12.050.
  24. Aranko, A. S., Oeemig, J. S., Zhou, D., Kajander, T., Wlodawer, A., and Iwaï, H. (2014) Structure-based engineering and comparison of novel split inteins for protein ligation, Mol. Biosyst., 10, 1023-1034, https://doi.org/10.1039/c4mb00021h.
  25. Lin, Y., Li, M., Song, H., Xu, L., Meng, Q., and Liu, X. Q. (2013) Protein trans-splicing of multiple atypical split inteins engineered from natural inteins, PLoS One, 8, e59516, https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0059516.
  26. Chong, S., Mersha, F. B., Comb, D. G., Scott, M. E., Landry, D., Vence, L. M., Perler, F. B., Benner, J., Kucera, R. B., Hirvonen, C. A., Pelletier, J. J., Paulus, H., and Xu, M. (1997) Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element, Gene, 192, 271-281, https://doi.org/10.1016/s0378-1119(97)00105-4.
  27. Perler, F. B. (2002) InBase, the intein database, Nucleic Acids Res., 30, 383-384, https://doi.org/10.1093/ nar/30.1.383.
  28. Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, T. J., Karplus, K., Li, W., Lopez, R., McWilliam, H., Remmert, M., Söding, J., Thompson, J. D., and Higgins, D. G. (2011) Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega, Mol. Syst. Biol., 7, 539, https://doi.org/10.1038/msb.2011.75.
  29. Hall, B. G. (2013). Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA, Mol. Biol. Evol., 30, 1229-1235, https://doi.org/10.1093/molbev/mst012.
  30. Abramson, J., Adler, J., Dunger, J., Evans, R., Green, T., Pritzel, A., Ronneberger, O., Willmore, L., Ballard, A. J., Bambrick, J., Bodenstein, S. W., Evans, D. A., Hung, C. C., O’Neill, M., Reiman, D., Tunyasuvunakool, K., Wu, Z., Žemgulytė, A., Arvaniti, E., Beattie, C., Bertolli, O., Bridgland, A., Cherepanov, A., Congreve, M., et al. (2024) Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3, Nature, 630, 493-500, https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w.
  31. Van der Spoel, D., Lindahl, E., Hess, B., Groenhof, G., Mark, A. E., and Berendsen, H. J. (2005) GROMACS: fast, flexible, and free, J. Comput. Chem., 26, 1701-1718, https://doi.org/10.1002/jcc.20291.
  32. Lindorff-Larsen, K., Piana, S., Palmo, K., Maragakis, P., Klepeis, J. L., Dror, R. O., and Shaw, D. E. (2010) Improved side-chain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field, Proteins, 78, 1950-1958, https://doi.org/10.1002/prot.22711.
  33. Sormanni, P., Aprile, F. A., and Vendruscolo, M. (2015) The CamSol method of rational design of protein mutants with enhanced solubility, J. Mol. Biol., 427, 478-490, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2014.09.026.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Сравнение структур TthDnaE1 и искусственного мини-интеина SspDnaB. Образующие HINT-домен N- и C-концевые участки полипептидной цепи показаны зелёным и оранжевым соответственно. Образованные аминокислотными остатками G87–V92 и L388–L406 β-тяжи показаны синим и красным соответственно

Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рис. 2. Модели структуры мини-интеинов TthDnaE1 Δ272 (а), Δ280 (б) и Δ287 (в)

Скачать (663KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Электрофоретический анализ продуктов сплайсинга гибридных белков, содержащих мини-интеин TthDnaE1 с делециями Δ272, Δ280 и Δ287 (15%-ный ДСН-ПААГ). Условные обозначения: «EIE» – нерасщеплённый мини-интеин, «EI» – остаточный белок без C-концевого экстеина, «IE» – остаточный белок без N-концевого экстеина, «I» – мини-интеин без экстеинов, «EE» – продукт лигирования экстеинов

Скачать (514KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Электрофоретический анализ продуктов расщепления гибридных белков на основе мини-интеина TthDnaE1 Δ280 без мутаций и с точечными заменами C1A, D405G и C1A/D405G. а – 15%-ный ДСН-ПААГ; б – 10%-ный трицин-ДСН-ПААГ. Условные обозначения – как на рис. 3; «EN» – N-концевой экстеин, «EC» – С-концевой экстеин

Скачать (1MB)
Метаданные
6. Рис. 5. Продукты расщепления гибридных белков на основе мини-интеина TthDnaE1 Δ280 (а, б) и его мутантных форм C1A (в, г), D405G (д, е) и C1A/D405G (ж, з) в зависимости от условий инкубации. а, в, д, ж – Содержание продуктов при рН 6,0 и температуре в диапазоне 20–80 °С; б, г, е, з – при 60 °C и pH в диапазоне 6,0–9,0. Белым цветом на диаграммах обозначен исходный гибридный белок, светло-серым цветом – продукт «I», тёмно-серым цветом – продукт «EI». Данные получены денситометрическим методом для 15%-ных ДСН-ПАА-гелей. «К» – гибридный белок до начала инкубации

Скачать (2MB)
Метаданные
7. Приложения
Скачать (5MB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025