Volatile organic compounds as potential biomarkers for the diagnosis of digestive diseases. A review

Full Text

Введение

Заболевания органов пищеварения отличаются большой распространенностью. Диагностика основных заболеваний этой группы дорога и часто довольно инвазивна, что сильно ограничивает ее доступность, а поздняя диагностика серьезно повышает риск осложнений и неблагоприятных исходов заболеваний [1], поэтому для многих болезней органов пищеварения сохраняется потребность в поиске надежного неинвазивного биомаркера, облегчающего диагностический поиск. Качество биомаркера заболевания определяется следующими критериями: наличием в периферических тканях организма или его выделениях (сыворотка крови, слюна, моча, каловые массы), способностью к идентификации и количественному определению с помощью экономически эффективных и надежных диагностических методик; кроме того, его присутствие должно быть связано с конкретным звеном патогенеза диагностируемого заболевания [2]. Такими свойствами обладают летучие органические соединения (ЛОС) – разнородная группа химических соединений с углеродным скелетом, которые образуются в результате биохимических реакций, связанных с воспалением, окислительным стрессом, бактериальной активностью или гибелью клеток. Доступными средами для их изучения являются моча, каловые массы и выдыхаемый воздух. Из сотен видов ЛОС, содержащихся в этих средах, большая часть представлена неспецифичными ЛОС, которые характерны для всех людей, и меньшей, специфичной частью, которая варьирует в зависимости от патофизиологических процессов и может указывать на наличие изменений в состоянии здоровья или появление заболевания. Часть ЛОС являются молекулами «чувства кворума» (quorum sensing) кишечной микрофлоры и могут служить для оценки численности отдельных представителей бактериальной массы кишечника [3]. ЛОС представляют собой конечные продукты метаболизма человека и жизнедеятельности микроорганизмов и могут быть выделены с помощью твердофазной микроэкстракции и проанализированы методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Дисбиоз и продукция ЛОС

Неблагоприятные изменения микробиома (дисбиоз) тесно связаны со многими патологическими состояниями как пищеварительной, так и других систем организма [4]. Крайне важным показателем здорового микробиома является величина его биоразнообразия, которая может быть утрачена из-за неправильного питания, нарушений иммунной регуляции, воспалительных изменений, применения антибиотиков и т.д. Кишечные бактерии ферментируют полисахариды с образованием специфических для каждого вида ЛОС на основе углеродной цепи. Например, Bacteroidetes продуцируют этановую, пропионовую, бутановую, пентановую и гексановую кислоты [5]. Профиль ЛОС имеет незначительные различия между здоровыми людьми, но очень существенно отличается при наличии заболеваний из-за изменения метаболической активности микроорганизмов, что можно использовать в качестве суррогатного маркера дисбиоза и некоторых заболеваний [6]. Наличие дисбиоза активирует внутриклеточные молекулярные сигнальные пути через рецепторы распознавания образов (PRRs), которые специализируются на выявлении молекулярных структур, связанных с повреждением (DAMPs), образованных погибшими / подвергнутыми стрессу клетками, или структур, связанных с патогенами (PAMPs), образованных микроорганизмами: например, липополисахаридов, липотейхоевой кислоты и пептидогликанов [7]. Рецепторы распознавания образов несут на себе эпителиоциты, нейтрофилы, фибробласты и антигенпрезентирующие клетки, из-за чего подобные патологические состояния вызывают сильный воспалительный и иммунный ответ [8]. Основой для определения DAMPs и PAMPs являются толл-подобные рецепторы, которые способны запускать сигнальный каскад с вовлечением ряда адаптерных белков, что ведет к активации ядерных факторов (NF-κB) и последующей продукции цитокинов и прочих молекул, ассоциированных с воспалением. В нормальном состоянии в кишке всегда присутствует физиологическое воспаление из-за взаимодействия PAMPs и DAMPs с PRRs, однако нормофлора сдерживает активацию NF-κB, что определяет оптимальный баланс про- и противовоспалительных медиаторов [9]. При формировании дисбиоза торможение активации NF-κB не происходит, из-за чего нарастание выраженности воспаления травмирует тканевые структуры и изменяет метаболическую активность микроорганизмов с изменением спектра образуемых ЛОС, которые можно выявлять в биообразцах.

Аналитические системы для оценки ЛОС

ГХ-МС – метод разделения компонентов в составе твердого или жидкого образца на основе различий по летучести и массе для последующей их идентификации [10]. Образец биоматериала нагревается до испарения в газообразную фазу и пропускается через капиллярную колонку с помощью инертного газа-носителя. Специальное покрытие колонки обеспечивает взаимодействие соединений в образце и замедление их перемещения для точной сепарации. После достижения конца колонки анализируемые вещества подвергают ионизации электронным ударом (70 эВ) для разделения их на катионы. Катионы перемещаются сквозь электромагнитное поле для разделения их по молекулярной массе, и специальный детектор считывает число ионов с определенной массой фрагмента, определяя соотношение масса/заряд [10]. Полученная информация передается на компьютер, где формируется масс-спектрограмма для идентификации компонентов образца. Для снижения потерь ЛОС в атмосферу метод ГХ-МС может быть дополнен твердофазной микроэкстракцией, когда ЛОС улавливаются адсорбирующими волокнами для последующей десорбции и выполнения анализа, минуя жидкую фазу классической ГХ-МС [11]. ГХ-МС отличается высокой чувствительностью, возможностью количественного анализа, отработанной методикой с обширной базой данных летучих соединений для выполнения сравнительного анализа. Применение данной методики ограничивает необходимость сложной стационарной дорогостоящей аппаратуры и высококвалифицированного персонала, высокие эксплуатационные расходы, трудоемкость пробоподготовки.

Метод спектрометрии ионной подвижности (FAIMS) базируется на способности ионизированных молекул любого вещества перемещаться в слабом электрическом поле (определяется отношение скорости дрейфа иона к напряженности электрического поля), что позволяет разделять ионы на основе их поведения в динамических электрических полях [12]. В камере ионизации электронный эмиттер формирует ионы молекул изучаемого биообразца в газовой фазе, которые перемещаются в камеру дрейфа, где асимметричное электрическое поле осуществляет пространственную дисперсию ионов: кратковременное приложение сильного поля притягивает катионы ко внутреннему электроду, затем воздействие слабого поля противоположной полярности в течение удвоенной продолжительности времени возвращает катионы к их первоначальным траекториям. Для каждого иона эта схема переключения напряжения повторяется тысячи раз, причем каждый цикл вызывает все большую дисперсию [13]. Только катионы со стабильной траекторией попадают в масс-спектрометр для распознавания молекул и регистрации их количества. Данный метод отличается меньшей сложностью пробоподготовки, меньшей стоимостью, чем ГХ-МС, высокой скоростью измерения, он может быть использован в портативных устройствах, но базы данных ЛОС для выполнения сравнения нуждаются в расширении, возможны трудности в идентификации некоторых ЛОС из-за наложения их спектров.

Метод протонной масс-спектрометрии (PTR-MS) позволяет количественно определять содержание ЛОС в воздухе до величины 1 ррм [14]. В основе метода лежат реакции ионов гидроксония (H3O+), которые осуществляют недиссоциативный перенос протона большинству ЛОС, не вступая в реакцию с компонентами воздуха, а квадрупольный масс-фильтр разделяет полученные ионы в зависимости от их соотношения масса/заряд, которые могут быть количественно оценены детектором (вторичным электронным умножителем). Набор распознаваемых данной методикой молекул имеет ограничения из-за того, что не все летучие вещества реагируют с ионом гидроксония. Выраженность данной проблемы существенно снижена при использовании метода масс-спектрального анализа летучих веществ в газообразных пробах (SIFT-MS), где ионы-предшественники реагируют с несколькими переносчиками протонов (NO⁺, O₂⁺, H₃O⁺) с образованием стабильных и предсказуемых продуктов ионизации, которые фокусируются квадрупольным масс-фильтром с разделением по соотношению масса/заряд и передаются на детектор для секвенирования [15]. Данные методики отличает высокая чувствительность, отсутствие пробоподготовки, широкий спектр определяемых молекул, однако используется дорогостоящее оборудование, может потребоваться разведение образцов из-за ограничения верхнего предела измерений концентрации, чувствительность ограничена для сложных молекул.

Биосенсоры – еще одна перспективная методика диагностики и скрининга заболеваний. Это довольно компактные устройства, измеряющие специфические маркеры из биообразцов (например, глюкозы в крови). Некоторые биосенсоры являются носимыми и обеспечивают выполнение непрерывных измерений [16]. Их преимущества – немедленный результат измерения, портативность, экономичность для здравоохранения из-за возможности надежного самоконтроля пациентов, предотвращающего ненужные визиты к врачу. Обычно они состоят из детектора молекул, генератора сигналов (оптического, электронного или магнитного), одноразового сенсорного устройства и индикатора интерфейса [17]. Раньше биосенсоры распознавали антитела, ферменты и аптамеры, сейчас у них появилась возможность обнаружения ЛОС, что позволит отслеживать динамику развития соответствующих заболеваний.

Технология «электронного носа» – это инструмент, который использует множество электрохимических датчиков с разной специфичностью с соответствующей системой распознавания образов для определения простых или сложных запахов [18]. Устройство состоит из системы подачи образца воздуха, системы обнаружения, которая оценивает физические изменения в датчике при адсорбции газообразных соединений на его поверхности, и системы алгоритмов машинного обучения, которые сопоставляют обнаруженную информацию с базами данных образцов запахов для формирования описания запаха образца [18]. В отличие от классических принципов ГХ-МС, анализирующей отдельные молекулы (спектрограмму), технология «электронный нос» взаимодействует с суммой отдельных ЛОС, генерируя совокупную кластерную сигнатуру запаха. Аппаратура «электронного носа» портативна, проста в эксплуатации, относительно недорога, что делает ее удобной для использования в клинических условиях [19]. Анализ главных компонент является основным методом для графического отображения распознанных «электронным носом» паттернов запаха в отличие от анализа спектрограммы отношения массы/заряда у остальных платформ определения ЛОС. Ортогональные переменные (главные компоненты) этого многомерного анализа экстраполируются из зависимых переменных набора данных и отображаются в виде точек на карте (паттернов сходства) [20]. Чем больше расстояние между основными компонентами, тем больше различий в структуре их составляющих, что позволяет различать профили ЛОС здоровых и больных людей. Возможности аппарата «электронного носа» могут сильно различаться в зависимости от типа использованных в нем сенсоров: каждый вид сенсоров использует уникальный принцип определения и чувствителен к определенному типу молекул, они отличаются временем реакции и восстановления, чувствительностью, физическими размерами, динамическим диапазоном и ценой.

В целях скрининга заболеваний органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) используют датчики на проводящих полимерах, металлооксидные, оптические, электрохимические датчики и кварцевые микровесы [21]. В данной технологии определенный прогресс точности и производительности получен благодаря внедрению в процесс выделения признаков искусственных нейронных сетей, когда объединяется несколько наборов входных данных для получения единого выходного сигнала, и использованию моделей глубокого обучения вместо используемых ранее линейных моделей [22, 23]. Определенной проблемой данной технологии является нарушение согласованности характеристик прибора из-за отклонения показаний датчиков со временем (дрейф) из-за физических изменений на поверхности датчиков в результате естественного старения или воздействия окружающей среды (температуры и влажности) [24]. Использование нескольких типов датчиков делает несопоставимыми их результаты, поскольку каждый тип датчиков генерирует уникальный ответ на один и тот же сигнал, что мешает обобщению результатов, полученных разными приборами на основе технологии «электронный нос» [19]. Применение технологий машинного распознавания образов на базе нейросетевого анализа, осуществляющего многофакторную ассоциацию ЛОС, сопряжено с риском выявления ложных ассоциаций из-за обработки огромных массивов информации (случайных совпадений, обусловленных влиянием закона больших чисел) [25].

Диагностика заболеваний ЖКТ с помощью ЛОС

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуются хроническим воспалением ЖКТ с периодами обострения и ремиссий. Хотя патофизиология ВЗК полностью не изучена, установлена ее достоверная связь с наличием дисбиоза [26]. Изменение активности бактерий – продуцентов короткоцепочечных жирных кислот (Clostridium и Faecalibacterium), муколитических микроорганизмов (Ruminococci) и сульфатредуцирующей флоры (Desulfovibrio) – отражается динамикой клинических проявлений заболевания [27]. Клиническими исследованиями установлено повышение концентрации индолов, спиртов и сложных эфиров у пациентов с активной болезнью Крона (БК); при достижении у них ремиссии концентрации этих соединений снижались до уровня, характерного для здоровых людей [28]. Кроме того, идентифицированы более специфичные маркеры обострения ВЗК – пропан-1-ол и 1-метил-4-пропан-2-илциклогекса-1,4-диен [29]. Прибором Cyranose 320 (США), построенным по технологии «электронный нос» с датчиками на основе проводящих полимеров, анализировали образцы кала от 55 детей с ВЗК в период обострения и ремиссии и 28 образцов кала контрольной группы [30]. Результаты показали, что Cyranose 320 способен успешно дифференцировать образцы стула пациентов с обострением ВЗК от образцов группы контроля. В другом исследовании такой же прибор более надежно различал группу контроля и пациентов с БК, чем пациентов с БК и неспецифическим язвенным колитом (НЯК) [31]. Анализ профиля ЛОС в фекалиях здоровых людей, пациентов с ВЗК и синдромом раздраженного кишечника (СРК) с помощью газовой хроматографии показал чувствительность 76% и специфичность 78% в дифференцировке между ВЗК и СРК и чувствительность 79% при дифференцировке ВЗК / здоровые люди [32]. При сопоставлении результатов оценки профилей ЛОС с помощью ХГ-МС в образцах мочи, кала, сыворотки крови и дыхании установлено, что образцы кала лучше отражают активность ВЗК, а БК определялась наиболее надежно по сравнению с другими заболеваниями [33]. Другой аппарат «электронного носа» Fox 4000 (Франция) с металлооксидными датчиками показал чувствительность 79,4–90,4% дифференцировки ВЗК и здоровых лиц в зависимости от использованной системы распознавания паттерна запаха [34]. Методом газовой хроматографии со спектрометрией ионной подвижности удалось отличать с высокой точностью здоровых добровольцев от пациентов с БК и НЯК как при наличии активности заболевания (кальпротектин >250 мг/г), так и в ремиссии (кальпротектин <100 мг/г), меньше различий удалось выявить между пациентами с БК и НЯК, и отличия отсутствовали между активным заболеванием и ремиссией внутри групп ВЗК [35]. Однако были установлены различия профилей ЛОС у пациентов в активном состоянии заболевания, которые в последующем достигли ремиссии, и теми, у кого активность сохранилась, что позволяет предсказывать течение заболевания у пациентов с ВЗК [36]. Использование метода масс-спектрального анализа летучих веществ в газообразных пробах у пациентов с ВЗК выявило у них высокие концентрации некоторых ЛОС в выдыхаемом воздухе, перспективных в качестве биомаркеров (диметилсульфид, сероводород, цианистый водород, аммиак, бутаналь и нонаналь) [37].

Проявления СРК иногда путают с дебютом ВЗК, его патогенез до конца не раскрыт, но предполагается, что дисбиоз (а именно соотношение бифидобактерий и актинобактерий) играет значимую роль в течении заболевания [38, 39]. Профили ЛОС у пациентов с СРК, оцененные с помощью ГХ-МС, значительно отличались от профилей пациентов с ВЗК и здоровых добровольцев, при этом чувствительность превышала 90% для каждой из групп сравнения за счет высокого содержания органических кислот и сложных эфиров у пациентов с СРК и увеличения доли альдегидов у пациентов с ВЗК [40]. Поскольку СРК – это диагноз исключения, внедрение оценки спектра ЛОС в клиническую практику позволит избежать ненужных инвазивных диагностических процедур.

Колоректальный рак (КРР) является третьим по распространенности и вторым по уровню смертности среди онкологических заболеваний. Наиболее эффективным методом скрининга КРР является колоноскопия, однако по эпидемиологическим данным США в 2015 г. только 6 из 10 нуждающихся в ней пациентов смогли выполнить эту процедуру из-за ее инвазивности, психологических проблем, пожилого возраста и отсутствия страховки [41]. Следовательно, потребность в неинвазивном скрининговом тесте КРР с высокой чувствительностью и специфичностью очень высока. Изучение клеточных линий колоректальной аденокарциномы мышей установило повышение концентрации 1-метоксигексана, 2,4-диметилгептана, ацетона, бутилированного гидрокситолуола [42]. При анализе кала на содержании ЛОС методом ГХ-МС у пациентов с КРР, аденоматозными полипами и здоровых лиц установлено, что одновременное присутствие пропана-2-ола, гексана-2-ола и этил-3-метилбутаноата увеличивает вероятность развития КРР в 6 раз [43]. В целом полученные результаты позволяют заключить, что для КРР характерны метаболические сдвиги в виде усиления протеолитической и ослабления сахаролитической ферментации [44]. В настоящее время основным методом скрининга КРР является иммунохимическое тестирование кала, чья чувствительность и специфичность составили 80 и 93% [45]. При комбинировании этой методики с анализом ЛОС в моче специфичность выросла до 97%. В другом исследовании обнаружено, что оценка ЛОС с помощью ГХ-МС у пациентов с положительным результатом анализа кала на скрытую кровь позволяла отличать пациентов с КРР от здоровых лиц (AUC 0,98) и от пациентов с аденомами (AUC 0,83), но разделение здоровых лиц и пациентов с аденомами было слабым (AUC 0,54) [46]. С помощью наиболее современных методик анализа спектра ЛОС в образцах кала пациентов с КРР выявили существенное повышение р-крезола и 3(4Н)-дибензофуранона по сравнению с образцами от здоровых лиц и пациентов с полипами, причем авторы сочли, что р-крезол является потенциальным биомаркером предраковых изменений с чувствительностью 83% и специфичностью 63% [47]. Прибор на базе технологии «электронный нос» Cyranose 320 также продемонстрировал возможность выявления отличий профилей ЛОС в кале между пациентами с КРР и здоровыми добровольцами и между здоровыми лицами и пациентами с аденомами тяжелой степени дисплазии [48].

Инфекционная диарея. Развитие диареи может быть обусловлено активностью многих микроорганизмов, но наиболее изученными с помощью оценки профилей ЛОС являются Clostridium difficile, холерный вибрион, Campylobacter jejuni и ротавирус [49]. Инфицированный C. difficile стул имеет характерный запах за счет наличия в нем серосодержащих соединений, карбоновых кислот с разветвленной цепью, изо-капроновой кислоты, фурановых соединений и 2-фтор-4-метилфенола [50]. С помощью ГХ-МС в стуле, инфицированном C. jejuni, выявлены высокие концентрации фенолов, органических кислот и индолов, а при ротавирусной инфекции – этилдодеканоата [51]. В другом исследовании с применением ГХ-МС установлено достоверное снижение количества молекул ЛОС у пациентов с НЯК (145 молекул), C. difficile (149 молекул) и C. jejuni (183 молекул) по сравнению со здоровыми людьми (297 молекул). Предполагается, что причиной такого сокращения числа молекул может быть ускорение кишечного транзита при этих заболеваниях, из-за чего микробиому не хватает времени для выработки части ЛОС [52].

Иным диагностическим подходом является выявление единственного биомаркера вместо распознавания профиля ЛОС. Так, для C. difficile таким маркером может стать 2-фтор-4-метилфенол, однако, несмотря на высокие показатели специфичности (100%) и чувствительности (83%), процесс определения ГХ-МС с твердофазной микроэкстракцией занимает 18 ч, что снижает его клиническую значимость из-за наличия более быстрых методик диагностики (например, полимеразной цепной реакции) [53]. Учитывая описанные трудности, наибольшим потенциалом в диагностике инфекционной диареи обладают технологии «электронного носа»: аппараты с металлооксидными датчиками и программным обеспечением на базе нейронной сети быстро различают профили летучих соединений здоровых лиц и пациентов с C. difficile с 85% чувствительностью и 80% специфичностью [54].

Целиакия. Заболевание проявляется выраженным воспалением тонкой кишки из-за опосредованной Т-лимфоцитами иммунной активации в ответ на употребление глютена восприимчивыми людьми. Заболевание диагностируется серологическими методами и биопсией двенадцатиперстной кишки для выявления характерных изменений слизистой оболочки [55]. Анализ профилей ЛОС с помощью ГХ-МС показал, что соблюдение безглютеновой диеты у детей привело к изменению состава микрофлоры и профиля ЛОС [56]. Даже при минимальном нарушении аглютеновой диеты шесть ЛОС оставались устойчиво изменены в течение 2 нед, а один (N-метилтаурин) – дольше этого периода, что может быть использовано для оценки приверженности аглютеновой диете [57]. Мягкое течение целиакии можно принять за СРК с диареей из-за сходной клинической картины, но при оценке ЛОС в моче пациентов обнаружено, что 1,3,5,7-циклооктатетраен выявлялся только у пациентов с целиакией [58].

В рамках пилотных исследований также выполнялись попытки оценивать профили ЛОС в кале для диагностики неалкогольной жировой болезни печени, некротизирующего энтероколита, лучевого поражения тазовых органов, гепатоцеллюлярной карциномы, где получены многообещающие результаты [59–62]. Синдром избыточного роста бактерий в тонкой кишке ввиду своей тесной патогенетической взаимосвязи с метаболической активностью микробиома и отсутствия надежного неинвазивного метода диагностики, а также высокой частоты рецидивов также нуждается в установлении характерного профиля ЛОС как надежного биомаркера этого состояния.

Кажется перспективным использование профилей ЛОС для более объективной оценки пищевого статуса и связанных с ним рисков – выявления биомаркеров, концентрация которых зависит от величины потребления определенных пищевых групп или нутриентов. Например, на рационе с высоким содержанием пищевых волокон падает содержание в выдыхаемом воздухе 2-метилмаслянной кислоты и 1-пропанола и растет у ацетоина и пропионовой кислоты [63]. Разработки этого направления оценки фактического питания позволят получать более точные результаты у лиц со сниженными коммуникативными возможностями (маленькие дети, пациенты старческого возраста, глухонемые и т.д.).

Заключение

Заболевания органов пищеварения очень распространены, а скрининг и диагностика некоторых из них дорогостоящи и сильно влияют на качество жизни пациентов в процессе диагностики. Использование ЛОС при скрининге и обследовании пациентов даст возможность обойтись без применения инвазивных методов диагностики и будет способствовать выявлению заболеваний на ранних стадиях. Это позволит избежать ненужных медицинских процедур и развития осложнений. Некоторые методики анализа спектра ЛОС неприменимы в клинической практике из-за своей стоимости, сложной пробоподготовки и использования весьма габаритного оборудования, но это инструмент научного поиска, который позволит выделить те ЛОС-биомаркеры заболеваний, оценка которых у постели больного с помощью более портативных методик, например технологии «электронный нос», позволит решать задачи одномоментного исключения нескольких заболеваний.

Раскрытие интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The author declares that he has no competing interests.

Вклад автора. Автор декларирует соответствие своего авторства международным критериям ICMJE.

Author’s contribution. The author declares the compliance of his authorship according to the international ICMJE criteria.

Источник финансирования. В рамках фундаментальных исследований №0410-2022-0005.

Funding source. Fundamental research No. 0410-2022-0005.

About the authors

Vladimir I. Pilipenko

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety

Author for correspondence.
Email: pilipenkowork@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5632-1880

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files