Neyrotroficheskaya terapiya i kontseptsiya «minipeptidov»

Abstract

Full Text

Нейротрофины. Открытие. Структура нейротрофинов и рецепторы Термин «нейротрофическая терапия» предполагает воздействия, которые способствуют функциональному сохранению структур нервной системы. В современном приложении это понятие ассоциируется, как правило, с нейротрофинами, которые оказываются посредниками в контроле основных функций здорового и больного мозга. В более детальном определении нейротрофины участвуют в регуляции деятельности как отдельных клеток мозга, так и нейрональной сети в целом: процессов синаптической пластичности; защиты от деструктивных воздействий окислительного стресса и апоптоза; стимулируют трансформацию прогениторных стволовых клеток как механизма заместительной репарации. Основой для концепции «нейротрофической терапии» стало открытие фактора роста нервов (NGF) и установление его способности стимулировать репарацию и выживание нейронов при повреждении [1, 2]. Существенным для понимания роли нейротрофинов явилась информация об их участии в контроле базисных клеточных процессов, значимых для развития, приспособительных реакций, старения и болезни организма. После открытия NGF и последующей паузы почти в 20 лет были выявлены другие нейротрофические ростовые факторы, которые обосновали целостную мозаику возможностей нейротрофической регуляции и нейротрофической терапии. Среди основных факторов этого комплекса: нейротрофический фактор мозга (BDNF), нейротрофины-3, -4 (NF-3, NF-4), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), инсулиноподобные нейротрофические факторы (IGF-1, IGF-2) и другие. Для каждого из них определена химическая структура (последовательность аминокислотных остатков в молекуле), активные «сайты» связывания с рецептором, «мотивы» биологической активности, особенности контроля физиологических и биохимических процессов в нейрональных структурах в норме и при патологии. Эти данные послужили толчком для проведения многих исследований с попыткой использования нейротрофинов в качестве терапевтических средств для нивелирования модельных или клинических заболеваний (типа патологии Альцгеймера и Паркинсона, ишемического инсульта и др.). Четверть века назад в своей нобелевской лекции первооткрыватель первого фактора роста Р.Леви-Монтальчини по сути предсказала идею нейротрофической терапии: «…поскольку гибель клеток нейрональной популяции может быть связана со сниженным уровнем нейротрофических факторов, таких как NGF, их экзогенная поддержка или стимуляция эндогенного продуцирования фармакологическими средствами может открыть обещающие подходы терапии…» [3]. Эффекты нейротрофинов осуществляются при взаимодействии с тирозинкиназными рецепторами – Trk-A, Trk-B, Trk-C. В то же время все названные нейротрофины взаимодействуют с «универсальным» p75NTR. Обнаруживается некая преферентность связывания определенного нейротрофина с рецепторами. Например, NGF предпочтительно взаимодействует с Trk-A, а BDNF – с Trk-B, тогда как NT-3 – c Trk-C или с Trk-A-рецепторами. Принципиально то, что после соединения рецептора с лигандом (определенным участком молекулы нейротрофина) запускается каскад химических реакций, специфичных для этого контакта. Взаимодействие нейротрофина с рецептором оказывается важным для последующего физиологического ответа. Такие реакции определяют выживание клетки, индукцию апоптоза или защиту от него, процессы клеточной дифференцировки и пролиферации. Связывание нейротрофина с рецептором приводит к активации каскада серин/треониновых киназ и далее транскрипторного фактора NF-kb, ключевой молекулы ДНК-сопряженного синтеза белков в ядре клетки. Например, BDNF, способный связываться с Trk-B или с p75NTR, запускает внутриклеточный сигнал, ведущий к выживанию или, напротив, гибели клетки. Эта информация получила большое развитие в последнее десятилетие, когда на основе структуры нейротрофинов после идентификации аминокислотных связок («мотивов») были созданы небольшие пептиды (mini-peptides), способные имитировать определенные эффекты целой нейротрофиновой молекулы. В итоге большой спектр регулируемых на уровне «нейротрофин-рецептор-сигнальная система» процессов в мозге может быть суммирован как триада «нейропротекция, нейрогенез, нейропластичность». Понятие «нейропротекция» определяет связанную с нейротрофинами естественную или терапевтическую стимуляцию физиолого-биохимических механизмов, способствующих структурной и функциональной устойчивости мозга. Нейропротекция в конкретном смысле включает: предотвращение гибели нейронов, стабилизацию цитоскелета, поддержание синаптической пластичности, защиту от окислительного стресса и апоптоза, ослабление депозитных образований, стимуляцию нейрогенеза. В идеологии современной медицины нейропротекция – особенно в приложении к нейродегенеративным и цереброваскулярным заболеваниям – должна начинаться до проявления клинической картины. Утвердившееся в полной мере на рубеже ХХ и ХХI вв. понятие «нейрогенез» устранило бытовое по сути представление о том, что «нервные клетки не восстанавливаются». Согласно большой доказательной базе экспериментальных и клинических работ установлена регулируемая трансформация нейральных стволовых клеток (прогениторов) – в нейроны, астроциты и олигодендроциты – с последующей миграцией в регионы мозга. С помощью специальных маркеров трансформация нейральных стволовых клеток выявляется в развивающемся мозге, при обучении, пребывании в благоприятной («обогащенной») среде, стрессе, гипоксии, а также невропатологии разного генеза [4]. В целом нейрогенез рассматривается как адаптивный процесс развивающегося и зрелого мозга: его роль состоит в усилении функционального потенциала мозга и/или компенсации при потере нервных элементов. Накоплено много фактов, подтверждающих роль нейротрофинов как обязательных компонентов регуляции нейрогенеза. Более того, стволовые клетки, «подвигнутые» к трансформации, сами продуцируют нейротрофины, ростовые факторы, белки нейрональной пластичности и нейропротекции [5]. Физиологическое понятие «нейропластичность» включает: баланс высвобождения и аксонального транспорта нейромедиаторов, пострецепторную экспрессию сигнальных молекул, формирование новых синапсов и дендритных сетей, поддержание долговременной потенциации нейронального электрогенеза (LTP), функциональную перенастройку отделов мозга. Нейропластичность может проявляться как на уровне отдельной клетки (реадаптация, защита от повреждения, компенсация функций), так и в интегративной деятельности мозга (мотивация, обучение, доминанта). Все эти определения важны как однозначные толкования, связанные с понятием «нейротрофическая терапия» и конкретизацией процессов, стимулируемых применением соответствующих этой терапии средств. Нарушение функций мозга связано с дефектом экспрессии нейротрофинов и их рецепторов Современные экспериментальные технологии позволяют установить роль нейротрофинов и нейротрофических рецепторов как регуляторных компонентов при патологии разного генеза. Особенности структуры нейротрофинов и связывание их с рецепторами оказываются значимыми факторами в этиологии и терапии нейродеструктивных заболеваний. Измененное содержание нейротрофинов и сниженная экспрессия тирозинкиназных рецепторов выявляются в зонах мозга при цереброваскулярной патологии, разных стадиях болезней Альцгеймера и Паркинсона. Такие результаты были получены как в клинических работах, так и в экспериментальных исследованиях, моделирующих эти заболевания [6, 7]. В первых работах этого направления было обнаружено, что сниженная экспрессия нейротрофинового рецептора в париетальной коре пациентов ассоциируется с болезнью Альцгеймера. Эти результаты трактовались как недостаточно индуцированная нейротрофинами сигнализация и их ограниченный трафик в холинергические нейроны [8]. Аналогичные данные были получены при постмортальном исследовании нейронов базальных ядер переднего мозга у таких больных [9]. Определение концентрации BDNF в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости у 30 пациентов с болезнью Альцгеймера разных стадий выявило увеличение содержания нейротрофина в начальной стадии заболевания. По мере прогрессирования заболевания уровень BDNF снижался, коррелируя с критериями MMSE [10, 11]. Также было обнаружено сниженное содержание NGF и редуцированная активность рецепторов TrkA и TrkB при деменции, отягощенной тельцами Леви и при болезни Паркинсона в холинергических нейронах базальных ядер [12]. На постмортальном материале пациентов болезни Паркинсона в базальных ядрах была выявлена измененная экспрессия BDNF и NGF, а также их рецепторов TrkA и TrkB [13]. С точки зрения молекулярной цитодиагностики неврологических заболеваний и возможностей избирательной фармакотерапевтической коррекции эти результаты служат основой для разработки новых терапевтических подходов. Экспериментальные исследования позволили в разных вариантах постановки задачи конкретизировать эту информацию. В опытах на трансгенной модели болезни Альцгеймера был выявлен сниженный уровень экспрессии нейротрофина (мРНК BDNF) и корреляция с образованием в коре мозга больших амилоидных агрегатов и тяжестью заболевания [14]. Было установлено, что подавление генной экспрессии Trk- (но не p75NTR) рецепторов усугубляет реакции модельной патологии Альцгеймера [15]. Эти результаты рассматриваются в контексте дисфункции холинергических нейронов переднего мозга в начальной фазе заболевания. Серия публикаций свидетельствует о связи инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) и его рецептора (IGF-1R) в патогенезе болезни Альцгеймера. Дефект функции рецептора IGF-1R и сопряженной сигнализации инсулинового рецептора выявляются в постмортальном материале таких пациентов, что расценивается как причина отягощения нейродегенерации [16, 17]. Таким образом, можно считать, что любые формы патологической дизрегуляции мозга связаны с нарушением функции нейротрофинов, в частности их синтеза и экспрессии специфических рецепторов. Более того, в некоторых ситуациях экспрессия рецептора становится фактором развития или усугубления определенных звеньев патологического процесса. Отсюда следует заключение, что терапевтическая коррекция таких патологических состояний может быть обеспечена влиянием на активность нейротрофического звена, то есть реализацией идеи Р.Леви-Монтальчини, которая, говоря об удивительной пластичности NGF, полагала, что «это свойство может модулироваться фармакологическими агентами, действующими по тому же пути, что и регуляция его синтеза и рилизинга». Минипептиды и концепция нейротрофической терапии Нейротрофины и ростовые факторы относятся к физиологически значимым пептидам, которые на клеточном уровне регулируют большой спектр процессов в здоровом, больном, стареющем мозге. В этот перечень входят: контроль роста и дифференцировки нейронов в развивающихся и переживающих системах, функциональная стабильность и пластичность нейрональных процессов, промотирование нейрогенеза. Среди многих химических регуляторов нейротрофинам принадлежит особая роль в защите и репарации мозга при ишемических, нейродегенеративных и травматических повреждениях. Это положение базируется на информации об особом регионарном синтезе нейротрофинов в мозге, доставкой по аксонам в соседние регионы и колокализации сопряженных с их эффектами рецепторов. Попытки в первичных клинических и экспериментальных исследованиях использовать нейротрофины и ростовые факторы путем непосредственного введения в желудочки мозга не получило развития. Фармакологический эффект нейротрофинов лимитируется их прохождением через гематоэнцефалический барьер. Крупные полипептидные молекулы подвергаются также быстрому гидролизу ферментами, присутствующими в крови. Недостаточно эффективной для практической медицины оказывается идея создания «трансферных систем» для проведения большой молекулы нейротрофина в мозг [18]. Концепция «нейротрофической терапии» в значительной мере остается декларативным постулатом. Хотя следует оговориться, что в ряде случаев не без успеха используются в клинике препараты, представляющие короткие наборы естественных пептидных фрагментов (Семакс, Церебролизин, Кортексин, Коопепт). В последнее десятилетие активно разрабатывается терапевтическая стратегия с использованием минипептидов – соединений, способных связываться с p75NTR и Trk-рецепторами и реализующих элементы нейротрофической активности. Такой подход сулит преимущества в лечении, воспроизводя протективные эффекты нейротрофинов и направленно влияя на активность рецептора. Речь может идти о веществах, которые, не будучи собственно нейротрофинами, но, специфически взаимодействуя с соответствующими рецепторами, стимулируют синтез и рилизинг других активных факторов в соответствующих регионах мозга. Согласно информации в базе данных PubMed, за последние 10 лет было опубликовано около 1300 ссылок, отвечающих запросу «mini-peptide». Исследования, основанные на современной рентгеноструктурной технике в сочетании с фармакотестированием, явились предпосылками к выявлению участков молекулы нейротрофина, ответственных за реализацию их эффектов. Молекулярная инженерия, посредством которой были созданы «химерные молекулы» NGF и BDNF, позволила аналитически вычленить структурные домены нейротрофинов (сочетания групп аминокислот), определяющих их специфические эффекты [19]. Одной из первых находок на этом пути стало выявление разных физиологических ответов – дифференцировка клеток, изменения клеточного цикла и промотирование апоптоза – с помощью дельта 9/13 мутанта NGF. Это вещество было создано как селективный лиганд рецептора p75NTR; полученные результаты свидетельствовали о возможности избирательной коррекции процессов, связанных с функцией нейротрофинов [20]. Последующий поиск таких структур представил ряд соединений, которые, взаимодействуя с Trk или p75NTR-рецепторами, демонстрировал эффекты нейротрофического профиля. В частности, было обнаружено, что синтетические аналоги BDNF, полученные как селективные фармакофоры структурной петли этого нейротрофина, связываясь с рецептором Trk-B, вызывали нейротрофические эффекты. На модели in vitro эти вещества предотвращали дегенерацию нейронов подобно «самому» BDNF. В опытах in vivo минипептиды активировали рецептор Trk-B в стриатуме и гиппокампе мышей и улучшали моторные и когнитивные функции после травмы мозга [21]. Существенно, что ряд минипептидов воспроизводит эффекты нейротрофинов за счет экспрессии активности последних. Такой механизм лежит в основе действия ноопепта (N-фенилацетил-L-пролилглицин этиловый эфир), когда была показана экспрессия мРНК BDNF и NGF в гиппокампе крыс [22] или другого препарата – нейропепа-1 (Met-Val-Gly), который, стимулируя мРНК BDNF, влиял на уровень нейротрофина и улучшал показатели поисковой поведенческой активности у крыс [23]. Таким образом, стратегия минипептидов представляет собой направление поиска новых продуктов, терапевтическое действие которых основано на модуляции активности рецепторов нейротрофинов. Минипептиды, способные специфически связываться с нейротрофиновыми рецепторами, могут избирательно экспрессировать или, напротив, блокировать трансдукторные сигналы в клетках мозга, защищая их от деструктивных процессов. Значимость возможного применения минипептидов как терапевтических средств состоит: а) в избирательности необходимых эффектов, вычленяемых из суммы плейотропной активности нейротрофинов; б) в возможности более «удобной» терапевтической аппликации ввиду небольшого размера молекулы. Стратегия «малых пептидов», находящаяся в большинстве своем в стадии доклинических разработок, призвана увеличить терапевтическую эффективность, аналогичную действию нейротрофинов, за счет лучшей биодоступности, стабилизации молекулы или пролонгирования необходимого эффекта. Церебролизин как пример нейротрофической терапии, реализуемой через минипептиды и пептидомиметики В списке современных ноотропных препаратов Церебролизин занимает важное место благодаря высокой эффективности, чрезвычайно низкому числу побочных проявлений, растущим примерам успешного применения при заболеваниях центральной нервной системы. У этого препарата хорошая клиническая история и высокая обоснованность, подтвержденная современными исследованиями. Церебролизин EVER Neuro Pharma GmbH представляет собой естественно сбалансированную смесь пептидов и аминокислот. Получаемый из мозга свиней путем специализированной ферментативной обработки Церебролизин включает около 15% пептидов с низким молекулярным весом (до 10 кДа) и набор основных аминокислот. Эти олигопептиды проявляют действие, сходное с эффектами нейротрофических факторов. Принято считать, что благодаря уникальному природному набору активных субстанций Церебролизин воздействует на разные «мишени» нейрональных структур и, соответственно, корригирует разные звенья патологического процесса в мозге. В результате взаимодействия комплекса химических компонентов, входящих в состав Церебролизина, с нейрональными структурами может быть достигнута нейротрофическая стимуляция разных популяций клеток центральной и периферической нервной системы [24]. Более чем 50-летний клинический опыт использования Церебролизина демонстрирует широкий спектр его эффективности: • ишемический и геморрагический инсульт; острый и реабилитационный периоды; • хронические цереброваскулярные расстройства; • нейродегенеративные расстройства разной этиологии (болезнь Альцгеймера, мультиинфарктная и сосудистая деменция и др.); • расстройства моторных функций, болезнь Паркинсона; • травма головного мозга и периферической нервной системы; • психосоматические расстройства как следствие экстремальных и стрессорных воздействий; • диабетическая полинейропатия; • детская цереброваскулярная патология. Таким образом, на основании широкого опыта клинического применения Церебролизина были разработаны эффективные схемы применения препарата во врачебной практике (см. рисунок). Обоснованность применения Церебролизина в клинике базируется на огромной и достоверной базе экспериментальных исследований. Профиль этих работ – от трансгенных моделей разных форм нейропатологии и опытов с культурами клеток до исследований поведенческого и когнитивного статуса видится чрезвычайно убедительным. Эти исследования документируют свойства Церебролизина как препарата с нейротрофической и нейропротективной активностью. Спектр исследованных нейрохимических и нейрофизиологических механизмов действия Церебролизина суммируется как целостная картина поддержания функции мозга и коррекции нарушений, связанных с патологией. Для лечения Церебролизином характерны: а) нейропротективная терапия – выживание клеток, поддержание жизнеспособности нейронов и их пластичности; б) компенсаторная (заместительная) терапия – ликвидация нейротрансмиттерного дефицита в поврежденных структурах мозга; в) вазоактивная терапия – обеспечение функционально достаточного метаболизма в мозге. Несмотря на многочисленные примеры участия природных нейротрофинов и ростовых факторов в нейропатологии разной природы их непосредственное применение как терапевтических средств не получило развития. Крупная молекула полипептида не проходит через гематоэнцефалический барьер, даже если можно было допустить невысокую степень гидролиза протеазами в кровеносном русле. Напротив, эффективность Церебролизина как терапевтического средства оказывается доказательной как при внутривенной, так и внутримышечной аппликации. Исследование химического состава подтвердили, что Церебролизин содержит более 100 коротких пептидов и белков с молекулярной массой до 5800 дальтон. Аминокислотный сиквенс выявил структуры в 3–6 аминокислот, исходно возникающих при трипсиновом гидролизе мозга свиньи. Важным результатом анализа явилась идентификация в этой среде физиологически активных пептидов тиролиберина, глутатиона, а также мотивов энкефалина и коллагена [25]. Ключевым в этом плане стало исследование Н.Chen и соавт. (2007 г.), когда было показано, что при инкубации Церебролизина с антителами к ростовым факторам выявлялось дозозависимое (от вносимой концентрации препарата) увеличение связывания с нейротрофическими факторами – CNTF, GDNF, IGF-1, IGF-2. Дополнительные опыты показали, что при блокаде CNTF устранялись эффекты Церебролизина в отношении стимулирования нейрогенеза в гиппокампе. Таким образом, это исследование подтвердило, что Церебролизин содержит химические структуры, сходные с CNTF, GDNF, IGF-1, IGF-2, которые и предопределяют разнообразие его нейротрофино-подобных эффектов [26]. Результаты многочисленных исследований доказывают значение этих нейротрофинов в патогенезе нейродеструктивных заболеваний мозга. Результаты, полученные на мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, свидетельствуют о локализации IGF-1 в местах отложений амилоидного белка. Сравнительный анализ указывает на участие IGF-1 в поддержании компенсаторной пластичности и выживания нейронов [27]. Для CNTF доказана активация пострецепторной трансдукторной системы, обеспечивающей защиту нервных клеток от дегенерации в условиях модельной патологии Альцгеймера [28]. При сравнении эффектов BDNF и GDNF в отношении защиты нигростиальных дофаминергических нейронов установлено преимущество последнего; на этой модели болезни Паркинсона была использована трансферная комбинация GDNF с безвирусным хелпером, которая улучшала поведенческие характеристики подопытных мышей [29]. Таким образом, спектр нейротрофинов, ассоциированных с коррекцией процессов нейродегенеративной патологии, представляется более широким, и потому приведенные данные о наличии в Церебролизине «мотивов» IGF, CNTF, GDNF и других нейротрофинов логично встраиваются в обоснование нейротрофической активности этого препарата. Считается, что в составе Церебролизина присутствуют отдельные аминокислоты или небольшие олигопептиды. Эти олигопептиды представляют собой отдельные блоки, аминокислотные «мотивы» нейротрофинов, специфичные для связывания с антителами или тирозинкиназными рецепторами. Можно полагать, что в работе H.Chen и соавт. [26] речь идет о присутствии в препарате Церебролизин не целостных молекул нейротрофинов (возможно ли такое после трипсинового гидролиза, предшествующего обработке мозгового материала?), а о пептидных фрагментах, повторяющих мотивы нейротрофических и ростовых факторов и определяющих терапевтические свойства препарата. Наличие пептидных структур, способных аналогично нейротрофинам связываться с тирозинкиназными рецепторами или потенцировать их аффинные свойства, служит объяснением: а) нейротрофино-подобной активности Церебролизина, реализуемой в широком спектре биохимических и физиологических реакций; б) высокой и разносторонней терапевтической активности Церебролизина, эффективного для лечения большого спектра заболеваний центральной нервной системы. Таким образом, можно говорить о сумме принципов действия Церебролизина как препарата с характерными нейротрофическими свойствами. Такое объяснение ставит конец интриге, связанной с плейотропным действием Церебролизина – действием, которое аналогично целому набору нейротрофических и ростовых факторов.