The relationship of JAK/STAT and MAPK/SAPK signaling pathways, NF-kB and content in the mononuclear cells of whole blood thioredoxins in the post-clinical stage of community-acquired pneumonia

Full Text

Состояние антиоксидантной защиты (АОЗ) во многом определяет активность процессов саногенеза, при этом дефицит антиоксидантов либо снижение активности ферментов АОЗ приводит к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ), что сопровождается нарушением структуры и функции мембран, активацией процессов апоптоза, сохранением провоспалительной активации иммунокомпетентных клеток [1, 2]. Усиление ПОЛ наблюдается в острую фазу воспаления, что тесно связано с активацией МАРК/SAPK-сигнального пути, в частности терминальных протеинкиназ р38 и JNK [1]. Вместе с тем ПОЛ играет важную физиологическую роль, регулируя процессы биосинтеза простагландинов, лейкотриенов, тромбоксана. При этом баланс АОЗ/ПОЛ поддерживается за счет функционирования специфических ферментов, катализирующих расщепление активных форм кислорода (АФК), в числе которых супероксиддисмутаза, каталаза, тиоредоксин (ТР), тиоредоксинредуктаза (ТРР). В настоящее время хорошо известна роль молекулярной системы ТР/ТРР в регуляции гемопоэза, поддержании жизнеспособности кардиомиоцитов и эндотелия [1, 3]. Вместе с тем нарушение баланса в данной системе приводит к изменению функциональной активности редокс-чувствительных молекул, включая фосфатазы PTEN, протеинкиназу ASK и др., с активацией соответствующих процессов, в числе которых апоптоз и повышение продукции провоспалительных медиаторов [2]. При этом редоксзависимая модификация внутриклеточных фосфатаз, являющихся регуляторами сигнальных путей, в том числе РТР1В, способствует изменению клеточной реактивности в отношении цитокинов [4]. Кроме этого, способствуя восстановлению цистеина в молекуле протеинкиназы р38, подвергшейся воздействию АФК, ТРР модулирует провоспалительную и проапоптозную активность данного сигнального пути, регулируя тем самым процессы саногенеза [5]. Установлено влияние ТР на функциональную активность Т-лимфоцитов, в частности возможность регуляции продукции интерлейкина (ИЛ)-4, интерферона-g за счет модуляции состояния ПОЛ/АОЗ [6, 7]. При этом ТР осуществляет прямое модулирующее влияние в отношении ядерного фактора транскрипции NF-kB за счет восстановления дисульфидных связей в димерах р50 и усиления ДНК-связывающих свойств транскрипционного фактора [8]. В системе ТР/ТРР фермент ТРР играет ключевую роль, восстанавливая окисленные SH-группы ТР, возвращая ферменту его каталитическую активность. Вместе с тем ТРР обладает способностью напрямую восстанавливать многие субстраты, в том числе гидроперекиси липидов, перекись водорода, дегидроаскорбиновую и липоевую кислоты, восстанавливая таким образом антиоксидантную активность витамина С [2]. Известно, что инфекционно-воспалительный процесс сопровождается существенным изменением баланса ПОЛ/АОЗ, который, как правило, полностью не восстанавливается при разрешении острых проявлений, сохраняясь длительное время, препятствуя разрешению клинических проявлений инфекции [9, 10]. Вместе с тем, несмотря на важность данного вопроса, взаимосвязи между компонентами, определяющими АОЗ, и компонентами сигнальных путей в настоящее время исследованы недостаточно полно, в связи с чем целью настоящего исследования явилось изучение взаимосвязи компонентов МАРК/SAPK- и JAK/STAT-сигнальных путей с содержанием в мононуклеарных клетках (МНК) цельной крови реконвалесцентов пневмонии ТРР. Материалы и методы Материалом для исследования служила венозная кровь, забиравшаяся в утренние часы (с 7:00 до 7:30) из локтевой вены. В основную (опытную) группу входили 30 пациентов мужского пола (средний возраст - 26±5,2 года) с бактериальной внебольничной пневмонией нетяжелого течения (60-65 баллов по шкале PORT) на 15-17-е сутки заболевания (непосредственно перед выпиской из клиники). Контрольную группу составили 15 практически здоровых доноров крови в возрасте 20-37 лет (средний возраст - 27±6 лет). Диагноз пневмонии верифицирован в соответствии с национальными клиническими рекомендациями, при этом критериями включения пациентов в исследование являлись: рентгенологическая верификация инфильтративных изменений в легких, односторонний сегментарный характер инфильтративных изменений, бактериологическая верификация грамположительных микроорганизмов, являющихся типичными возбудителями пневмонии (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus), а также Mycoplasma pneumoniae, неосложненное течение заболевания, положительный эффект проводимой терапии (уменьшение объема инфильтративных изменений не менее чем на 2/3 от исходного уровня к моменту выписки из стационара). Все пациенты получали парентеральную антибиотикотерапию цефалоспоринами III поколения (цефотаксим) в среднесуточной дозировке 2 г либо кларитромицином в среднесуточной дозе 1 г, нестероидные противовоспалительные препараты, физиотерапевтическое лечение. Проведение клинического исследования было одобрено ученым советом и локальным этическим комитетом медицинского института ФГБОУ ВО ТулГУ (протокол №2 от 01.09.2014). Все пациенты и доноры подписывали информированное согласие. В работе использовали наборы для культивирования и митогенной стимуляции клеток цельной крови Цитокин-Стимул-Бест (ЗАО «Вектор Бест», Новосибирск); 1 мл цельной крови в стерильных условиях вносили во флакон, содержащий 4 мл поддерживающей среды DMEM, гепарин (2,5 ЕД/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Все образцы крови помещали в термостат (37°С) и инкубировали в течение 24 ч. После инкубации из флаконов с образцами крови забирали 1 мл супернатанта для определения общей антиоксидантной активности с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Для получения фракции МНК 4 мл клеточной суспензии наслаивали на раствор фиколла-верографина (p=1,077; «МедБиоСпектр», Россия) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Выделенные МНК дважды отмывали в фосфатно-солевом буфере и 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5¥106 клеток, лизировали, используя раствор следующего состава (Sigma-Aldrich, США): 10 mM Tris, pH 7,4; 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 10% глицерола, 0,1% SDS, 0,5% деоксихолата, 1 mM PMSF (матричный 0,3 М раствор в DMSO). В лизирующий раствор добавляли (ex temporo) 1% коктейля ингибитора протеаз (Sigma-Aldrich, США), выдерживали на льду (при температуре 4-50°C) в течение 15 мин, аликвотировали и замораживали при -760°С. В полученных лизатах методом ИФА оценивали содержание (нг/мл) сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции STAT3, STAT5A, STAT6, стрессактивируемой протеинкиназы JNK изоформ 1 и 2 (JNK1/2), киназы экстраклеточного роста изоформ 1 и 2 (ERK1/2), митогенактивируемой протеинкиназы p38, ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (IkBa) и уровень субъединицы р65 ядерного фактора транскрипции NF-kB. Также определяли уровень фосфорилирования (ед/нг) по серину в положении 32 [pS32] ингибитора ядерного фактора транскрипции NF-kB (IkBa), уровень фосфорилирования по треонину/тирозину в положении 180/182 [pT/180/Y182] митогенактивируемой протеинкиназы р38, уровень фосфорилирования по треонину/тирозину в положении 183/185 стресс-активируемой протеинкиназы JNK1/2 [pY183/T185], уровень фосфорилирования по тирозину/треонину в положении 202/204 киназы экстраклеточного роста ERK1/2 [pT202/Y204]. Кроме того, оценивали степень фосфорилирования по тирозину в положении 705 сигнального трансдуктора и активатора транскрипции STAT3, по тирозину в положении 694 - STAT5А и по тирозину в положении 641 - STAT6. ИФА проводили на анализаторе Personal LAB (Adaltis Italia S.p.A., Италия). Для определения исследуемых факторов в лизатах МНК использовали наборы реактивов Thermo Fisher Scientific, США; Cusabio Biotech, Китай; Panomix, США; Bender Medsystems, Австрия; Cloud-Clone, США; IBL, Германия. Подсчет клеток и анализ их жизнеспособности выполняли на счетчике клеток TC20 (Bio-Rad, США). Жизнеспособность выделенных клеток превышала 90%. Статистическую обработку осуществляли с применением программы Statistica 7.0. Результаты исследования представлены в виде: медиана выборки; 25 и 75-й процентили (25, 75%). Статистическую значимость (р) межгрупповых различий в несвязанных выборках оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни, в связанных - с использованием Т-критерия Уилкоксона. Взаимосвязи между исследуемыми факторами оценивали методом линейного регрессионного анализа. Результаты и обсуждение Результаты исследования представлены в табл. 1. Анализ результатов исследования показал, что у реконвалесцентов ВП имеет место дефицит АОЗ, проявляющийся снижением концентрации в супернатанте антиоксидантов на 6,7% (р=0,051), сочетающийся с повышением в МНК содержания ТРР на 16,3% (р=0,028). Средние значения межгрупповых различий представлены на рисунке. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о статистически значимом повышении в МНК у реконвалесцентов ВП содержания STAT5A (р<0,0001), STAT6 (р=0,0002), р38 (р=0,0002), р65 (р=0,06), IkBa (р<0,0001). При этом имело место снижение фосфорилирования STAT5A (р<0,0001), STAT3 (р<0,0001), STAT6 (р<0,0001), JNK (р<0,0001), IkBa (р<0,0001). Таким образом, у реконвалесцентов ВП имеет место угнетение фосфорилирования компонентов MAPK/SAPK- и JAK/STAT-сигнальных путей при их достаточном содержании в МНК, сопровождающееся уменьшением антиоксидантного статуса клеточного супернатанта. Снижение уровня фосфорилирования IkBa при повышении содержания субъединицы р65 позволяет говорить о формировании тенденции к инактивации и подавлении транскрипции генов, контролируемых NF-kB. Зафиксированные изменения могут рассматриваться как дисрегуляторные проявления патологического процесса, определяющиеся угнетением трансдукции рецепторных сигналов в МНК. Повышение уровня ТРР на фоне снижения концентрации антиоксидантов может оцениваться как дезадаптивное проявление, определяющееся истощением пула антиоксидантов, включая значительное число окисленных соединений, в том числе окисленных SH-групп белков, образующихся в ходе воспалительного процесса. В этих условиях угнетение фосфорилирования рассматриваемых внутриклеточных регуляторов также может являться следствием дефицита тиолов [1, 5, 11]. Кроме того, АФК в условиях дефицита факторов АОЗ, окисляя SH-группы, препятствуют трансактивирующему действию STAT-факторов, затрудняя их димеризацию. Таким образом, уровень ТРР может являться маркером дисфункции системы ПОЛ/АОЗ у реконвалесцентов ВП. Исследование характера взаимосвязи между компонентами сигнальных путей и ТРР проведено методом линейного регрессионного анализа с пошаговым включением факторов в регрессионную модель. Результаты анализа представлены в табл. 2. Результаты анализа свидетельствуют о том, что коэффициент корреляции регрессионного уравнения (R), отражающий силу связи показателя ТРР с комбинацией факторов, включенных в модель, составил 0,99, коэффициент детерминации, определяющий долю изменчивости значений ТРР, объясняемую полученной математической моделью (R2), составил 0,98 (скорректированный коэффициент детерминации - 0,97), указывая на высокую степень влияния исследуемых показателей на уровень ТРР. Модель характеризуется статистической значимостью, на что также указывает значение F-критерия (F=266,5; p<0,0000), и низкой корреляцией остатков (коэффициент Дарбина-Уотсона равен 1,5; коэффициент линейной корреляции остатков - 0,21). Стандартная ошибка оценки модели - 0,26 ед. Анализ полученных результатов, в частности стандартизированных коэффициентов корреляции, позволяет говорить о том, что наиболее значимый вклад в изменение уровня ТРР вносит протеин STAT5A, под влиянием которого имеет место повышение содержания в клетке исследуемого фермента. Существенно менее значимо влияние на данный показатель STAT6 и р65. Содержание IkB, а также уровень фосфорилирования STAT6 не отличаются статистически значимым характером взаимосвязи с уровнем ТРР. Отрицательное влияние на ТРР оказывают фосфорилированная форма р38 и IkB, а также JNK1/2, при этом влияние двух последних факторов на концентрацию ТРР не достигает статистической значимости. Различия стандартизированных регрессионных коэффициентов для STAT5A и р38 позволяют оценить различия в степени их влияния на уровень ТРР, что соотносится как 3,4:1. Таким образом, результаты проведенного анализа свидетельствуют о статистически значимых взаимосвязях ТРР с содержанием в МНК STAT5A, STAT6, p65, IkB, а также уровнем фосфорилирования протеинкиназы p38. Анализ корреляций указанных факторов (частных корреляций), отличающихся статистически значимым характером связи и ТРР, представлен в табл. 3. Анализ частных корреляций свидетельствует о том, что STAT5A и ТРР отличаются наиболее тесной взаимосвязью друг с другом, носящей умеренный положительный характер. Слабой положительной связью также характеризуется взаимосвязь ТРР с уровнем р65 и STAT6. Слабое отрицательное влияние на содержание в МНК ТРР оказывает фосфорилированная форма р38. Низкое значение получастной корреляции для всех включенных в модель факторов указывает на то, что каждые из включенных факторов отличаются уникальным вкладом в изменчивость ТРР, который не может быть объяснен влиянием других показателей. Обсуждение результатов Постклиническая фаза ВП протекает на фоне снижения фосфорилирования компонентов JAK/STAT, в особенности STAT5A и STAT6, и MAPK/SAPK-сигнального пути (включая терминальные протеинкиназы р38 и JNK), сопровождаясь при этом угнетением активности ядерного фактора транскрипции NF-kB, что позволяет говорить о дисфункции сигнальных путей и снижении чувствительности МНК к воздействию цитокинов. На этом фоне отмечается дефицит антиоксидантов, включая тиоловые соединения, наблюдаемый при сравнительно высоком уровне ТРР. Указанное обстоятельство может объясняться дефицитом в организме обследованных таких микроэлементов, как селен, необходимых для эффективной работы ферментов АОЗ. При этом указанные изменения позволяют говорить о дисрегуляции системы АОЗ/ПОЛ у данных больных, что, очевидно, требует соответствующей коррекции [12]. В настоящем исследовании выявлена положительная взаимосвязь между уровнем сигнального трансдуктора, активатора транскрипции STAT5А и содержанием в МНК ТРР. Менее сильная взаимосвязь выявлена между ТРР и р65, а также STAT6, при этом установлена обратная зависимость между содержанием фосфорилированной формы протеинкиназы р38 и ТРР. Положительный характер взаимосвязи ТРР с указанными факторами, с одной стороны, отражает роль данных компонентов внутриклеточной сигнализации в АОЗ, а с другой - позволяет говорить о том, что система ТР/ТРР участвует в регуляции молекулярных механизмов сигналинга цитокинов, в том числе ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-4, эритропоэтина и тромбопоэтина, а также других факторов, принимая участие в регуляции пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток, включая иммунокомпетентные [2, 3, 6]. Учитывая способность ТРР восстанавливать активность редокс-чувствительных фосфатаз, в частности PTP1B, вовлеченных в регуляцию JAK/STAT-сигнального пути, молекулярным механизмом такого влияния может стать модуляция функциональной активности факторов транскрипции STAT3 и STAT5 [13]. В свою очередь, негативная взаимосвязь уровня фосфорилирования р38 и ТРР позволяет говорить о том, что ТРР является одним из компонентов стресс-лимитирующих механизмов, ограничивающих активность МАРК/SAPK-сигнального пути, обеспечивая при этом противовоспалительное действие и ограничение процессов апоптоза инициированных АФК [4, 5, 14, 15]. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о взаимосвязи МАРК/SAPK- и JAK/STAT-сигнальных путей с уровнем ТРР, отличающихся противоположным влиянием регулятора тиолового обмена на исследованные внутриклеточные молекулярные механизмы трансдукции рецепторных сигналов. Выводы 1. Стадия реконвалесценции ВП характеризуется дефицитом АОЗ, проявляющейся снижением концентрации в супернатанте антиоксидантов на 6,7% (р=0,051), несмотря на имеющее место повышение уровня в МНК ТРР на 16,3% (р=0,028). Указанное обстоятельство свидетельствует о целесообразности коррекции АОЗ у пациентов, перенесших ВП. 2. Дефицит антиоксидантов у реконвалесцентов ВП ассоциирован с повышением в МНК содержания STAT5A (р<0,0001), STAT6 (р=0,0002), р38 (р=0,0002), р65 (р=0,06) и IkBa (р<0,0001) и одновременным снижением уровня фосфорилирования STAT5A (р<0,0001), STAT3 (р<0,0001), STAT6 (р<0,0001), JNK (р<0,0001), IkBa (р<0,0001), отражая дефицит активности данных факторов. 3. Проведенный анализ выявил достоверную связь уровня ТРР и STAT5A, а также р65 и STAT6, характеризующуюся положительной корреляцией. Указанное обстоятельство свидетельствует о модулирующем влиянии ТРР на молекулярные механизмы сигналинга цитокинов, в том числе ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-4, эритропоэтина и т.п. Отрицательная взаимосвязь ТРР с фосфорилированием протеинкиназы р38 указывает на участие ТРР в формировании стресс-лимитирующих реакций у реконвалесцентов ВП, обусловленных ограничением активности МАРК/SAPK-сигнального пути.

About the authors

S. S Bondar

Tula State University

300012, Russian Federation, Tula, pr. Lenina, d. 92

I. V Terekhov

Tula State University

Email: trft@mail.ru
300012, Russian Federation, Tula, pr. Lenina, d. 92

V. S Nikiforov

I.I.Mechnikov North-West State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: viktor.nikiforov@szgmu.ru
191015, Russian Federation, Saint Petersburg, ul. Kirochnaia, d. 41

V. K Parfenyuk

V.I.Razumovsky Saratov State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

410012, Russian Federation, Saratov, ul. Bol'shaia Kazach'ia, d. 112

N. V Bondar

I.S.Turgenev Orel State University

Email: bon.nelli@yandex.ru
302026, Russian Federation, Orel, ul. Komsomolskaya, d. 95

References

Supplementary files