Microbiota of the upper respiratory tract in children with chronic adenoiditis

Full Text

Введение

Изучение микробиоты респираторного тракта является актуальным в связи с переосмыслением ее состава и значения в развитии инфекций верхних дыхательных путей (ВДП) [1].

До недавнего времени большинство опубликованных работ было посвящено изучению бактериальных сообществ ВДП, которое проводилось культуральными методами, при этом 60–80% микроорганизмов слизистой оболочки носоглотки не доступно для культуральных методов исследования [2].

Взятие качественного мазка из носоглотки ребенка при рутинном исследовании на приеме ЛОР-врача или педиатра не представляется возможным из-за неприятных и болезненных манипуляций. Доказано, что бактериальные сообщества, входящие в состав микробиоты ВДП, участвуют в развитии иммунной системы, устойчивости к инфекциям и формировании биопленок [3].

Для клинической диагностики микроорганизмов, входящих в состав биопленки, используют различные молекулярные методы, в том числе газовую хроматографию (ГХ) и ее сочетание с масс-спектрометрией (ГХ-МС)¹. Метод ГХ-МС, в отличие от применяемого в обычной практике посева клинического материала на культуральные среды, позволяет получить информацию о «замаскированной» части микст-инфекции, состоящей из некультивируемых в условиях лабораторий клинической микробиологии микроорганизмов [4].

Цель исследования – сравнительный анализ микробиоты с поверхности глоточной миндалины, из глубоких отделов носа и слюны у детей с хроническим аденоидитом.

Материалы и методы

На основании проведенных осмотров в исследование включены 90 пациентов в возрасте от 3 до 12 лет с диагнозами «хронический аденоидит» (ХА) и/или «гипертрофия глоточной миндалины» (ГГМ). Данное исследование было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого». Родители всех участников исследования предоставили письменное согласие. Набор пациентов проводился на базе оториноларингологического отделения Краевой клинической больницы г. Красноярска в период с 2014 по 2017 г. Критериями включения были клинические проявления хронического аденоидита с абсолютными показаниями для хирургического лечения [5] и не менее трех курсов консервативной терапии в анамнезе. Критериями исключения являлись обострения хронического аденоидита и противопоказания к хирургическому лечению. У всех участников исследования взяты мазки с поверхности глоточной миндалины, из глубоких отделов полости носа и слюна как биологическая жидкость полости рта. Образцы из полости носа взяты путем введения тампона в общий носовой ход между перегородкой и средней носовой раковиной, избегая контакта с преддверьем полости носа. Материал с поверхности слизистой оболочки глоточной миндалины забирали при помощи дополнительного тампона, который вводили через рот, предварительно отодвинув мягкое небо небодержателем, и вращательными движениями проводили сбор материала с поверхности глоточной миндалины перед ее удалением, не задевая слизистую оболочку полости рта и языка [6].

Образцы из полости рта были представлены слюной, набранной под языком инсулиновым шприцом 1 мл [7]. Полученные образцы вместе с тампоном были непосредственно помещены в пробирки Эппендорфа и в течение 1 ч доставлялись в лабораторию. Для оценки состава микробного сообщества на поверхности глоточной миндалины проводили идентификацию микроорганизмов по специфическим жирным кислотам методом ГХ-МС.

Для описания микробиоты различных отделов ВДП применен «экологический подход», используемый при описании микробных сообществ, где человек и множество разнообразных микроорганизмов – это единая экосистема. Видовой состав микроорганизмов формируется качественно и количественно в зависимости от характера микроэкологии в биотопах, он сложился эволюционно и со временем приобретает устойчивость [1]. При этом значимость каждого вида в сообществе оценивают, используя показатели численности и частоты встречаемости (Р. Уиттекер, 1980), также существует понятие доминант, которое определяется по методике С.И. Сытник (1988). Степень доминантности и встречаемости определенных типологических групп микроорганизмов определяется по методу М.Б. Наткевичайте-Иванаускене [8].

Статистический анализ полученных результатов осуществляли по общепринятым методикам в операционной среде Windows XP, а также в программе StatSoft Statistica 6.0. Сравнения долей пациентов, у которых доминирующие микроорганизмы встречаются в достаточном количестве, производились по z-критерию достоверности различия долей и с помощью анализа четырехпольных таблиц по критерию χ2 в программе Statistica [9].

Результаты

На этапе начального анализа мы произвели дополнительную выборку доминирующих микроорганизмов с поверхности глоточной миндалины, из глубоких отделов носа и слюны среди обследуемых пациентов с частотой встречаемости более 40%. Полученные результаты были включены в наш анализ (табл. 1).

 

Таблица 1. Состав бактериального сообщества, взятого с поверхности глоточной миндалины, из глубоких отделов полости носа и слюны, n=90; уровень значимости нулевой гипотезы, рассчитанный по критерию достоверности различия долей и с помощью анализа четырехпольных таблиц по критерию χ²

Микроорганизм	Доли пациентов, доля ± SD			Уровень значимости (критерий достоверности различия долей/критерий χ2)
	миндалина	нос	слюна	миндалина–нос	миндалина–слюна
Clostridium histolyticum	0,59±0,05	0,74±0,05	0,29±0,05	0,036*/0,027*	<0,001**/<0,001**
Clostridium ramosum	0,90±0,03	0,60±0,05	0,42±0,05	<0,001**/<0,001**	<0,001**/<0,001**
Fusobacterium/Haemophilus	0,93±0,03	0,46±0,05	0,19±0,04	<0,001**/<0,001**	<0,001**/<0,001**
Staphylococcus intermedius	0,79±0,04	0,37±0,05	0,23±0,04	<0,001**/<0,001**	<0,001**/<0,001**
Lactobacillus	0,69±0,05	1,00±0,01	0,29±0,05	<0,001**/<0,001**	<0,001**/<0,001**
Candida	1,00±0,01	0,9±0,031	0,90±0,03	0,005*/0,004*	0,002*/0,003*
Bifidobacterium	0,83±0,04	0,77±0,04	0,42±0,05	0,317/0,267	<0,001**/<0,001**
Streptococcus mutans	0,79±0,04	0,77±0,04	0,00±0,01	0,747/0,720	<0,001**/<0,001**
Propionibacterium acnes	0,97±0,02	0,86±0,04	0,32±0,05	0,010*/0,009*	<0,001**/<0,001**
Actinomycetes 10Me14	0,79±0,04	0,69±0,05	0,00±0,01	0,130/0,127	<0,001**/<0,001**
Propionibacterium jensenii	0,97±0,02	0,86±0,04	0,23±0,04	0,010*/0,009*	<0,001**/<0,001**
Pseudonocardia	0,52±0,05	0,66±0,05	0,32±0,05	0,060/0,070	0,008*/0,007*
Enterobacteriaceae (E. coli и др.)	1,00±0,01	0,83±0,04	0,00±0,01	<0,001**/<0,001**	<0,001**/<0,001**
Clostridium perfringens	0,31±0,05	0,83±0,04	0,48±0,05	<0,001**/<0,001**	0,024*/0,022*
Selemonas	0,00±0,01	0,00±0,01	0,52±0,05	1/1	<0,001**/<0,001**
Clostridium propionicum	0,03±0,02	0,00±0,01	0,71±0,05	0,101/0,081	<0,001**/<0,001**
Эпштейна–Барр	0,00±0,01	0,00±0,01	0,68±0,05	1/1	<0,001**/<0,001**
Herpes	0,52±0,05	0,57±0,05	0,61±0,05	0,502/0,550	0,229/0,229
E.lentum 7741 (группа В)	0,34±0,05	0,40±0,05	0,81±0,04	0,407/0,441	<0,001**/<0,001**
Микроскопические грибы (кампестерол)	0,35±0,05	0,31±0,05	0,74±0,05	0,570/0,634	<0,001**/<0,001**
Ruminococcus	0,24±0,05	0,86±0,04	0,90±0,03	<0,001**/<0,001**	<0,001**/<0,001**

Примечание. * – уровень значимости различий р<0,05, ** – уровень значимости различий р<0,001. Для нулевых и 100% долей стандартное отклонение SD рассчитано с поправкой Ван дер Вардена.

 

Маркеры Clostridium histolyticum, Clostridium ramosum, Lactobacillus, Campylobacter mucosalis, Candida, Bifidobacterium, Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans, микроскопические грибы (ситостерол), Propionibacterium acnes, Actinomycetes 10Me14, грибы (Aspergillus-тип), Propionibacterium jensenii обнаружены во всех образцах, взятых с поверхности глоточной миндалины и из полости носа. Частота их встречаемости составила от 70 до 100% среди всех пациентов. При этом частота их встречаемости в слюне составила 8–40%. Определялись явные количественные и качественные различия между составом микробиоты носовой и ротовой полостей у детей с хроническим аденоидитом и/или гипертрофией глоточной миндалины в сравнении с микробиотой слюны.

По результатам проведенного исследования оказалось, что микробиота носоглотки по своему качественному составу идентична микроорганизмам из глубоких отделов носа: Clostridium histolyticum, Clostridium ramosum, Pseudonocardia, Fusobacterium/Haemophilus, Staphylococcus intermedius, Lactobacillus, Campylobacter mucosalis, Enterobacteriaceae, Clostridium perfringens, Candida, Bifidobacterium, Helicobacter pylori, Actinomyces viscosus, Streptococcus mutans, микроскопические грибы (ситостерол), Propionibacterium acnes, Actinomycetes 10Me14, Stenotrophomonas maltophilia, грибы (Aspergillus-тип), Propionibacterium jensenii. При этом преобладание количественного состава некоторых доминирующих микроорганизмов в носовой полости указывает на воздушный путь их иммиграции, и наоборот, в редких случаях среднее число микроорганизмов в глоточной миндалине преобладает над численностью в полости носа, что указывает на то, что причиной гипертрофии глоточной миндалины или хронического аденоидита может быть гастроэзофагеальный рефлюкс [10] (рис. 1).

 

Рис. 1. Структура микробиоты с поверхности глоточной миндалины, из глубоких отделов носа и слюны, n=90.

 

Обсуждение

По данным литературы, состав микробиома ВДП определяется тремя экологическими факторами:

1) микробная иммиграция в дыхательных путях;

2) элиминация микробов из дыхательных путей;

3) бактериальная колонизация, определяемая местными условиями роста микроорганизмов [11].

Причиной любого изменения в микробиоме при болезненных состояниях должно быть отклонение в этих факторах. С учетом того, что в нашем исследовании участвовали дети с диагнозом «хронический аденоидит» вне обострения после нескольких курсов санации носоглотки и системной антибиотикотерапии, концентрация микробных маркеров в глубоких отделах носовой полости была выше из-за микробной иммиграции из вдыхаемого воздуха, густо заселенного бактериями. При этом влияние микробной элиминации, обеспечиваемой мукоцилиарным клиренсом, чиханием, врожденной и адаптивной иммунной защитой в носоглотке, выражено больше, чем в полости носа. Давно признанный феномен бактериальной колонизации при хронических заболеваниях ВДП отражает обогащенный рост видов, которые хорошо адаптированы к конкретным условиям окружающей среды поврежденных дыхательных путей. Важно, что метод ГХ-ММ регистрирует микроорганизмы по их маркерам и его чувствительность не снижается от их концентрации [12]. Наиболее распространенными микроорганизмами в полости рта оказались Streptococcus, Selemonas, Alcaligenes, Porphyromonas, Candida, Eubacterium/Cl. сoccoides, Staphylococcus, Eubacterium moniliforme, E. nodatum, E. sabureum, Clostridium perfringens, Herpes, Clostridium 12:0group, Butyrivibrio/Cl. fimetarum (рис. 1). Так, Clostridium propionicum в большом количестве определялась в слюне, следы ее присутствуют и в миндалине, отсутствовала в полости носа. Основные отличия микробного состава слюны от микробиома полости носа и глоточной миндалины обеспечили такие малоизвестные клиницистам микроорганизмы: Selemonas, Alcaligenes, Clostridium 12:0group. Частота встречаемости этих микроорганизмов варьировала от 50 до 90% в слюне и не встречались в полости носа и на поверхности глоточной миндалины. Часть микроорганизмов все же встречались во всех обследуемых отделах ВДП: Porphyromonas, Микроскопические грибы (кампестерол), Ruminococcus, E. lentum 7741 (группа В), однако частота их встречаемости в слюне варьировала от 60 до 90%, в то время как в глоточной миндалине они встречались редко и в небольших количествах – от 3 до 20% и еще меньше в носу – 1–5%.

Проведен статистический анализ (рассчитаны различия долей и произведен анализ четырехпольных таблиц по критерию χ²) состава бактериального сообщества, взятого с поверхности глоточной миндалины, из глубоких отделов полости носа и слюны. Доли пациентов, в анализах которых как на миндалине, так и в полости носа в большом количестве присутствуют бактерии Bifidobacterium, Streptococcus mutans, Actinomycetes 10Me14, Pseudonocardia, Selemonas, Clostridium propionicum, Эпштейна–Барр, Herpes. E. lentum 7741 (группа В), микроскопические грибы кампестерол, значимо не различались. В то же время у некоторых пациентов часть микроорганизмов доминировали именно на поверхности глоточной миндалины: Clostridium histolyticum, Clostridium ramosum, Fusobacterium/Haemophilus, Staphylococcus intermedius, Lactobacillus, Candida, Propionibacterium acnes, Propionibacterium jensenii, Enterobacteriaceae (E. coli и др.), Clostridium perfringens, Ruminococcus, они различаются на уровне р<0,05, что можно объяснить иммиграцией микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта при гастроэзофагеальном рефлюксе.

При сравнении микробиоты в полости рта (слюне) и на миндалине отмечено, что перечисленные бактерии присутствуют в большом количестве именно в слюне, существенные различия наблюдаются для всех бактерий (р<0,05), кроме Herpes (р<0,229).

Заключение

Таким образом, по результатам сравнительного исследования микробного сообщества с поверхности глоточной миндалины, полости носа и слюны определяется идентичность микробиоты полости носа и носоглотки, что позволяет считать микробиом этих отделов ВДП общим и использовать это в клинической практике для оценки микробиоты носоглотки по мазкам из глубоких отделов носа.

В то же время микробиота полости рта по результатам анализа микробных маркеров слюны показала значительные отличия как количественного, так и качественного состава микроорганизмов в сравнении с микробиотой носоглотки, что исключает возможность использования слюны для оценки микробиоты носоглотки и ВДП в целом.

Внедрение метода ГХ-МС для оценки микробиоты ВДП позволит проводить ее мониторинг в клинической практике для лечения хронической патологии дыхательной системы без нарушения экологии слизистых оболочек и всего организма в целом.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. И.В. Андриянова, С.Г. Вахрушев – руководство исследованием; И.В. Андриянова – взятие образцов; Н.Ю. Романова, И.В. Андриянова, Н.А. Ильенкова – упорядочивание результатов и статистическая обработка; И.В. Андриянова, Н.А. Ильенкова – написание рукописи; С.Г. Вахрушев – редактирование рукописи. Все авторы исследования прочитали и одобрили финальный материал.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. I.V. Andriyanova, S.G. Vakhrushev – study management; I.V. Andriyanova – sampling; N.Yu. Romanova, I.V. Andriyanova, N.A. Ilyenkova – data systemization and statistical processing; I.V. Andriyanova, N.A. Ilyenkova – writing the manuscript; S.G. Vakhrushev – editing the manuscript. All study authors read and approved the final paper.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

 

¹ Осипов Г.А., Белобородова Н.В. Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма. Пат. РФ № 2146368, РФ МПК G01N33/48, G01N33/52; заявл. 21.10.1997 [Osipov GA, Beloborodova NV. A method for detecting the causative agent of the infectious process in sterile biological environments of a macroorganism. Pat. RF No. 2146368, RF MPK G01N33/48, G01N33/52; application 21.10.1997 (in Russian)].

About the authors

Irina V. Andriyanova

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: irina-doc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4917-9358

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Krasnoyarsk

Natalya A. Ilyenkova

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: ilenkova1@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8058-7806

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Krasnoyarsk

Sergey G. Vakhrushev

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: vsg20061@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7774-0969

D. Sci. (Med.), Prof.

Russian Federation, Krasnoyarsk

Natalia Iu. Romanova

Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: medfizika@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8520-4314

Cand. Sci. (Ph.-Math.)

Russian Federation, Krasnoyarsk

References

Supplementary files