Giperaktivnyy mochevoy puzyr' u bol'nykh pozhilogo vozrasta

Full Text

В настоящее время человечество стремительно стареет. В начале прошлого века, в 1900 г., средняя продолжительность жизни была 32 года, а число людей в возрасте старше 65 лет в развитых странах не превышало 4%. Сейчас люди старше 65 лет составляют 14%, а в некоторых странах - 20%. По оценкам экспертов, доля пожилых людей в России к 2010 г. возрастет до 21,9%, а к 2015 г. - до 24%. В связи с этим все специалисты, особенно врачи первичного звена, должны быть готовы к такой "эпидемии". С возрастом значительно увеличивается число больных с различными расстройствами функции нижних мочевых путей, особенно это относится к гиперактивному мочевому пузырю - ГМП (рис. 1) [1, 2]. ГМП - это клинический синдром, подразумевающий ургентные позывы на мочеиспускание с наличием или без ургентного недержания мочи, обычно в сочетании с учащенным мочеиспусканием (число мочеиспусканий более 8 раз в сутки) и ноктурией (2 ночных пробуждения для мочеиспускания и более) [3]. Диагноз устанавливают при отсутствии каких-либо гормональных, метаболических или других очевидных заболеваний (инфекция мочевых путей, рак мочевого пузыря, аденома простаты и т.д.), способных вызвать имеющиеся симптомы. Ургентность (внезапный непреодолимый позыв на мочеиспускание) является ключевым симптомом, без которого диагноз ГМП неправомерен, в отличие от жалоб на недержание мочи, которое может отсутствовать. Ургентное недержание мочи или так называемый мокрый ГМП встречается у 1/3 больных ГМП. По данным эпидемиологических исследований, в Европе и США частота встречаемости ГМП составляет около 17% [2, 4]. Полагают, что императивным мочеиспусканием страдают 16-19% взрослого населения России [5]. С возрастом исследователи отмечают значительное увеличение доли "мокрого" ГМП [4]. В возрасте от 65 до 74 лет ургентное недержание мочи отмечают до 20% женщин. По данным шведского исследования, у пожилых людей 75 лет и старше ургентным недержанием мочи страдают 42% женщин и 35% мужчин [6]. ГМП оказывает выраженное негативное влияние на качество жизни [4]. Ургентное и учащенное мочеиспускание и ургентное недержание мочи значительно отражаются на дневной деятельности и ночном сне. Непредсказуемые эпизоды ургентного недержания являются причиной повышенной тревоги, снижения самооценки больных и депрессии [7]. У пожилых людей недержание мочи связано с повышенным риском суицидных попыток, превышающим риск при таких заболеваниях, как застойная сердечная недостаточность, хронические легочные обструктивные заболевания и болевые синдромы с умеренной степенью боли [8]. Кроме того, ГМП в сочетании с ургентным недержанием мочи повышает риск падений и костных переломов (на 26 и 34% соответственно), в результате того что больные вынуждены мчаться в туалет при возникновении позыва. Такой травматизм особенно выражен у пожилых больных с ограниченной подвижностью, в ночное время и незнакомых условиях. По данным исследования Brown, 55% больных ГМП отмечают по меньшей мере 1 падение в течение года и 5% - 3 раза и более за год [9]. Наряду с этим ГМП с ургентным недержанием мочи очень часто сопровождается промежностным дерматитом с образованием язв. На 138% увеличена частота инфекции мочевых путей у таких больных [10]. Точно охарактеризовать каким образом возрастные изменения влияют на развитие симптомов ГМП достаточно сложно. Во-первых, для этого требуются исследования с продолжительным периодом наблюдения. Во-вторых, пожилые люди страдают большим количеством сопутствующих заболеваний, и нередко трудно понять, какие изменения являются истинно возрастными, а какие связаны с имеющимися болезнями. И, в-третьих, неоднородность пожилой популяции не способствует выявлению того, что же является "нормой" у таких людей. ГМП и лежащая в его основе детрузорная гиперактивность (непроизвольное сокращение детрузора в фазу наполнения мочевого пузыря) относятся к нарушению накопительной функции мочевого пузыря. Современные представления указывают на многофакторное развитие ГМП, однако до конца вопросы патогенеза ГМП остаются не изученными. Описаны ряд возрастных изменений детрузора, которые могут быть причиной ГМП. Ультраструктурные изменения детрузора у пожилых с детрузорной гиперактивностью характеризуются умеренным расширением межклеточных пространств между гладкими миоцитами, отсутствием нормальных межклеточных соединений, которые замещаются большим количеством соединений по типу протрузий и тесным сближением участков сарколеммы. Эти изменения сочетаются с распространенной дегенерацией мышечных клеток и аксонов [11], что может объяснять снижение массы мочевого пузыря [12]. Имеются данные о том, что с возрастом уменьшается выделение ацетилхолина из нервных окончаний, при этом увеличивается его продукция клетками уротелия [13]. При растяжении уротелия происходит выделение ацетилхолина, который, вероятно, играет роль в регуляции сокращения мочевого пузыря и развитии детрузорной гиперактивности. Кроме этого, выявлены изменения в механизме регуляции тонуса детрузора, в котором участвует аденозинтрифосфорная кислота. Последняя, так же как и ацетилхолин, выделяется уротелием при его растяжении. При этом увеличение числа пуринергических рецепторов Р2Х2, выявленное у больных с детрузорной гиперактивностью, может также играть роль в развитии симптомов ГМП [14]. Тем не менее следует иметь в виду, что наличие детрузорной гиперактивности, выявленной при уродинамическом исследовании, не означает, что больной должен страдать недержанием мочи. К примеру, бессимптомная детрузорная гиперактивность регистрируется у 42% здоровых женщин старше 65 лет [2]. Выделяют ряд состояний, которые могут быть независимой от возраста причиной ГМП, усугубить его течение или способствовать развитию сходных симптомов. В первую очередь к ним относят неврологические расстройства. Нарушение контроля над накопительной функцией мочевого пузыря может быть следствием супрасакральных повреждений, таких как рассеянный склероз, травмы и вертеброгенные заболевания спинного мозга и супраспинальных нарушений в результате цереброваскулярных заболеваний, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и т.д. Сахарный диабет также может способствовать развитию симптомов ГМП. Полиурия и как следствие учащенное мочеиспускание - известный симптом этого заболевания. Кроме того, длительно текущая гипергликемия может привести к периферической невропатии и развитию ГМП, иногда в сочетании с нарушением сократительной способности мочевого пузыря. Следующим состоянием, тесно связанным с симптомами ГМП, особенно ноктурией, является застойная сердечная недостаточность [15]. Это связано с возвратом в положении лежа большого объема жидкости, который депонировался в нижних конечностях в вертикальном положении. Аналогичная ситуация имеет место при венозной недостаточности. Ноктурия может быть результатом нарушения секреции вазопрессина и натрийуретического гормона, даже при отсутствии застойной сердечной или венозной недостаточности. Частота встречаемости ноктурии может достигать 90% к 80 годам. Важно иметь в виду, что ноктурия является многофакторным состоянием и может быть как следствием нарушения функции нижних мочевых путей, так и следствием первичных расстройств сна и ночной полиурии. У пожилых мужчин развитие симптомов ГМП часто сопровождается инфравезикальной обструкцией в результате заболеваний простаты. Около 60% мужчин с инфравезикальной обструкцией отмечают симптомы ГМП [16]. Точного объяснения взаимосвязи между инфравезикальной обструкцией и ГМП пока нет. Существующие исследования указывают на ряд неврологических изменений [17, 18] и увеличение a-адренергической активности в результате ишемии детрузора [19] вследствие его гипертрофии на фоне инфравезикальной обструкции. Считается, что постменопаузальный период также связан с повышенный риском развития ГМП. Однако роль половых гормонов при этом не ясна. Результаты применения заместительной гормональной терапии (ЗГТ) у таких больных неоднозначны, и вместо улучшения ЗГТ может приводить к ухудшению симптомов ГМП [20, 21]. К другим факторам риска ГМП относят инфекцию мочевых путей, запоры, повышенный индекс массы тела, курение и употребление напитков, содержащих кофеин, алкоголь и заменители сахара [22]. Таким образом, ряд анатомических и физиологических изменений, сопутствующих старению, могут предрасполагать к развитию симптомов ГМП. Несмотря на это, недержание мочи нельзя рассматривать как естественный признак старения. В дополнение к этому некоторые функциональные нарушения, такие как ограниченная подвижность, нарушение функции верхних конечностей и снижение зрения могут усугубить течение ГМП. Следует иметь в виду, что фармакологические препараты, применяемые по поводу сопутствующих заболеваний, также могут играть определенную роль. Например, мочегонные средства могут способствовать значительному увеличению потребности посещения туалета для мочеиспускания и имитировать симптомы ГМП. Учитывая большое количество причин, способных вызвать симптомы ГМП и ургентное недержание мочи, большое значение при обследовании уже на этапе первичного звена приобретает тщательный сбор анамнеза. Он должен включать в том числе беседу с лицами, ухаживающими за больным, если таковые есть, для уточнения возможных привычек, связанных с посещением туалета, и эпизодов недержания мочи, о которых сами больные могут не сообщать. Важно учитывать все принимаемые медикаментозные средства, которые, как правило, назначают в избытке пожилым людям с большим набором болезней. Часто больные не в состоянии перечислить их все, и в этом случае следует попросить принести все препараты с собой. Урологическое обследование больных ГМП является стандартным, направленным в первую очередь на исключение других очевидных причин имеющихся симптомов. В первую очередь он включает дневник мочеиспускания, общий анализ, бактериологическое исследование мочи, ультразвуковое исследование (УЗИ), анализ осадка мочи, УЗИ почек и мочевого пузыря с определением остаточной мочи [1]. В последующем возможно проведение дополнительных инструментальных методов обследования, таких как цистоскопия и/или уродинамическое исследование. Показанием для этого может быть отсутствие эффекта от проводимого лечения, хроническая инфекция мочевых путей, пролапс гениталий, ранее проведенные хирургические вмешательства, лучевая терапия или сочетание симптомов нарушения накопления мочи и опорожнения мочевого пузыря. При обследовании пожилых больных с симптомами нижних мочевых путей, включая ГМП, необходимо уделить дополнительное внимание состоянию легочной, сердечно-сосудистой, нервной систем, наличию отеков нижних конечностей, оценить двигательные возможности и психический статус. Одной из трудных задач является лечение ГМП у больных пожилого возраста с тяжелыми сопутствующими заболеваниями. Несмотря на то что в целом тактика лечения одинакова у всех больных ГМП, необходимо учитывать ограниченную подвижность при выборе метода лечения. Этот факт отражен в материалах Консультации по недержанию мочи в 2005 г., в которых отмечено, что у больных пожилого возраста с тяжелыми сопутствующими заболеваниями и с отсутствием возможности улучшить нарушенные функции вероятность избавления от недержания крайне низка [23]. Принимая во внимание многофакторность проблемы ГМП и ургентного недержания у больных пожилого возраста с высокой частотой разных сопутствующих заболеваний, лечение должно проводиться объединенными усилиями урологов, гинекологов и терапевтов. Как и у молодых пациентов, лечение больных ГМП пожилого возраста должно начинаться с поведенческой терапии. Она включает в себя изменение привычек поведения, режима питания и приема жидкости, тренировку мочевого пузыря и ведение дневника мочеиспускания. Больным с сохраненной когнитивной функцией можно рекомендовать режим отложенного мочеиспускания или мочеиспускание под контролем ухаживающих лиц больным со снижением умственной деятельности. Такая терапия направлена на восстановление произвольного контроля над функцией мочевого пузыря. Одной из разновидностей поведенческой терапии является гимнастика мышц тазового дна по Kegel [24]. Она проводится аналогично больным со стрессовым недержанием мочи, однако при ГМП упражнения помогают больным подавлять непроизвольные сокращения детрузора и одновременно улучшить контроль над запирательным механизмом уретры. Гимнастику рекомендуют проводить ежедневно по несколько подходов в день в различных положениях (лежа, сидя или стоя). Некоторые больные не в состоянии выполнить такие упражнения из-за того, что им трудно идентифицировать требуемые мышцы, и в этом случае возможно применение электростимуляции мышц или методики биологической обратной связи. Последняя позволяет больным при помощи звуковых, визуальных или тактильных сигналов контролировать мышечное сокращение и расслабление. Она не только помогает больным овладеть своими мышцами, но также способствует усилению мотивации лечения в целом. Существует несколько вариантов регистрации мышечной активности и проведения обратной связи. К ним относят влагалищные конусы, влагалищную и анальную манометрию и электромиографию. Перечисленные методики не требуют посторонней помощи и пригодны для использования в домашних условиях. Более трудоемкий и требующий специального оборудования и условий уродинамической лаборатории способ - это обратная связь путем регистрации детрузорного, внутриуретрального давления и электромиографии сфинктера уретры. Продолжительность поведенческой терапии, включая все ее разновидности, может достигать 16 нед, что требует от больных терпения и настойчивости. Важно, чтобы процедуры проводились регулярно, вне зависимости от положительных или отрицательных результатов. Больные должны понимать, что для достижения эффекта может потребоваться время. Тем не менее при отсутствии улучшения после 8 нед следует пересмотреть методику и обсудить с больным выбор альтернативного метода лечения. Таким образом, поведенческая терапия в своем широком понятии основана на процессе обучения. Потому больные, отобранные для поведенческой терапии, должны не просто быть способными к ее проведению, но также желать ее. Результаты такой терапии во многом определяются активным участием и настойчивостью больных. И перед началом лечения больные должны четко представлять суть методики, ожидать реальные результаты и быть настроенными на активное участие. Эффективность и безопасность поведенческой терапии доказаны в ряде исследований, однако их недостатком являлось небольшое количество наблюдений, и сравнение результатов лечения затруднено разнообразием методик и режима их проведения [25]. Для повышения эффективности поведенческой терапии ее сочетают с лечением антихолинергическими препаратами. Медикаментозное лечение больных ГМП является ведущим методом улучшения накопительной способности мочевого пузыря. Основными представителями антихолинергических средств для лечения больных ГМП являются оксибутинин, толтеродин и троспиум. В скором времени станут доступными для клинического применения препараты солифенацин и дарифенацин, селективное действие которых в настоящее время исследуется. Механизм действия антихолинергических средств заключается в блокаде постсинаптических мускариновых холинорецепторов детрузора. Вследствие этого уменьшается или предупреждается действие ацетилхолина на детрузор во время фазы накопления, что приводит к уменьшению его гиперактивности. К другим медикаментозным препаратам для лечения ГМП относят миотропные спазмолитические релаксанты (флавоксат), антагонисты ионов кальция (нифедипин, верапамил), трициклические антидепресанты (имипрамин), а также агонисты гамма-аминомаслянной кислоты (диазепам). Результаты лечения препаратами этих групп во многом уступают блокаторам мускариновых рецепторов, поэтому обычно их используют в сочетании с последними. При назначении медикаментозных средств больным с нарушением функции нижних мочевых путей, включая ГМП, необходимо учитывать, что возрастные изменения могут значительно нарушать фармакокинетику и фармакодинамику лекарственных средств. Увеличение жировой массы у пожилых людей приводит к увеличению периода полувыведения липофильных препаратов. Печеночная и почечная недостаточность, часто наблюдаемые в пожилом возрасте, и гипоальбуминемия способствуют увеличению в плазме крови концентрации белка, связывающего лекарственные вещества. Изменяется фармакодинамика рецепторов. И наконец, в пожилом возрасте больные в среднем принимают одновременно по 5 разных препаратов, что может привести к взаимодействию лекарственных средств и возникновению дополнительных побочных эффектов, способных повлиять на развитие симптомов нижних мочевых путей. Наиболее типичными побочными эффектами антихолинергических средств являются сухость во рту, запоры, нарушение зрения и когнитивной функции. Возрастные изменения фармакокинетики и фармакодинамики и взаимодействие с другими лекарственными средствами могут значительно увеличить частоту возникновения этих побочных эффектов, даже при низких дозах препаратов. Последствия этих побочных эффектов могут носить еще более тяжелый характер. Так, например, длительно существующая сухость во рту может вызвать кариес, который в свою очередь приведет к выпадению зубов, что может отразиться на выборе употребляемой пищи, массе тела и качестве жизни. Антихолинергические препараты могут усугубить запоры, к которым у пожилых уже имеется предрасположенность, и тем самым увеличить частоту эпизодов недержания мочи. Очевидно, что ухудшение уже ослабленного зрения у людей пожилого возраста отразится на их повседневной активности и безопасности [26]. Рис. Распространенность ГМП в разных возрастных группах [2]. Таблица. Сравнительная эффективность различных антимукскариновых препаратов Автор, год Препарат, доза Среднее изменение числа мочеиспусканий в сутки Среднее изменение числа эпизодов недержания в сутки Препарат (n) плацебо (n) препарат (n) плацебо (n) Chapple, 2004 Толтеродин IR 2 мг 2 раза в сутки ↓1,9 (263) ↓1,2 (267) ↓1,1 (263) ↓0,8 (267) Landis, 2004 Толтеродин ER 4 мг в сутки ↓1,9 (492) ↓0,4 (494) ↓1,3 (492) ↓0,7 (494) Chapple, 2004 Солифенацин 10 мг в сутки ↓2,6 (264) ↓1,2 (253) ↓1,4 (127) ↓0,6 (127) Chapple, 2005 Дарифенацин 15 мг в сутки ↓1,9 (330) ↓1,0 (385) ↓4,8 (324) ↓2,7 (378) Zinner, 2004 Троспиум 20 мг 2 раза в сутки ↓2,4 (256) ↓1,3 (256) ↓2,3 (256) ↓1,9 (256) Rudy, 2006 Троспиум 20 мг 2 раза в сутки ↓2,7 (323) ↓1,7 (325) ↓1,9 (323) ↓1,3 (325) Dmochowksi, 2002 Оксибутинин 1,3 мг в сутки 2,6 мг в сутки 3,9 мг в сутки 2 раза в неделю ↓1,8 (130) ↓1,7 (133) ↓2,3 (125) (p=0,0457) ↓1,7 (132) ↓2,1 ↓2,0 ↓2,7 (p=0,0165) ↓2,1 Вопрос об ухудшении когнитивной функции в результате применения антихолинергических препаратов остается спорным. Имеется исследование, указывающее на отрицательный эффект оксибутинина на указанную функцию [27] и клинические случаи спутанности сознания и снижения памяти у больных, принимавших толтеродин [28]. Однако клиническая значимость этих наблюдений окончательно не ясна. Более значимым является возможность развития делирия у больных, принимающих комбинацию антихолинергических препаратов и ингибиторов холинэстеразы [29], поскольку последние являются рекомендованным средством для лечения легких степеней нарушения когнитивной функции и болезни Альцгеймера. Люди с болезнью Альцгеймера больше других подвержены риску нарушения когнитивной функции при лечении антихолинергическими препаратами из-за имеющихся нарушений холинергической активности центральной нервной системы, однако этот факт требует дальнейшего изучения. И наконец, остается не ясным, играют ли какую-нибудь роль возрастные изменения в гематоэнцефалическом барьере для применения антихолинергических препаратов в лечении ГМП [30]. Учитывая изложенные аспекты, определенные преимущества при использовании у пожилых людей, страдающих ГМП, имеет антимускариновый препарат троспия хлорид. Будучи гидрофильным производным атропина и имея положительно заряженную молекулу, он является четвертичным амином, практически не проникает через гематоэнцефалический барьер, медленно всасывается из желудочно-кишечного тракта и обладает низкой биодоступностью (около 10%). Хотя биодоступность троспия хлорида уступает таковой третичных аминов, это не оказывает влияния на его эффективность, а только определяет необходимость его применения в более высоких дозах. Обычно препарат назначают в индивидуально подобранных дозировках, от 10 до 30 мг 2-3 раза в сутки, в зависимости от клинической картины и тяжести заболевания. Препарат рекомендуется принимать до еды, так как при приеме совместно с пищей его биодоступность значительно снижается. Троспия хлорид лишь в незначительной степени подвергается печеночному метаболизму, что определяет низкую вероятность его фармакокинетического взаимодействия с другими лекарственными препаратами. Таким образом, применение троспия хлорида особенно показано пациентам, постоянно принимающим несколько медикаментозных препаратов, что особенно актуально в группе пожилых больных. Другим важным следствием указанных особенностей метаболизма троспия хлорида является выделение большей части (до 80%) препарата с мочой в неизмененном виде, в то время как для оксибутинина и толтеродина этот показатель не превышает 5%. Накопление троспия хлорида в мочевом пузыре может приводить к дополнительному местному воздействию, существование которого показано в исследованиях его внутрипузырного применения. Все это является одним из объяснений меньшего числа системных побочных эффектов и лучшей переносимости троспия по сравнению с другими антихолинергическими препаратами [30]. Учитывая то, что большая доля троспия выводится по средствам канальцевой секреции и клубочковой фильтрации в почках, возможно взаимодействие препарата с другим средствами, активно секретируемыми нефронами, такими как дигоксин, морфин и др. Поэтому одновременное применение указанных препаратов может замедлить выделение троспия, повысить его сывороточную концентрацию и тем самым усугубить его побочные эффекты, связанные с блокадой мускариновых рецепторов (сухость во рту, запоры) [31]. Период полувыведения троспия хлорида в среднем составляет от 12 до 18 ч, препарат не кумулируется, что позволяет принимать его 2 или 3 раза в день. Клинический эффект от применения препарата отмечается на 3-и сутки от начала лечения и достигает своего максимума в период с 3-х по 7-е сутки. Таким образом, троспия хлорид является удобным в применении препаратом. Поскольку троспия хлорид уже более 20 лет применяется для лечения больных ГМП, его эффективность доказана во многих исследованиях, результаты наиболее достоверных из них, проведенных за последние 4 года, суммированы в таблице. Одним из дискутируемых вопросов является безопасность применение антихолинергических препаратов для лечения симптомов ГМП у мужчин с инфравезикальной обструкцией. Снижение сократительной способности детрузора под действием этих препаратов у таких больных может привести к увеличению объема остаточной мочи и задержке мочеиспускания. Однако недавние исследования толтеродина у мужчин с инфравезикальной обструкцией продемонстрировали хорошую переносимость и отсутствие клинически значимых изменений скорости мочеиспускания, объема остаточной мочи или частоты задержки мочеиспускания [32]. В последние годы в лечении больных ГМП используют нейромодуляцию, под которой понимают процесс формирования утраченного механизма действия (мочеиспускания) при помощи прямой или опосредованной стимуляции нервных волокон слабым электрическим током. Иными словами, нервная стимуляция представляет собой прямое или опосредованное (через мышечные волокна, кожу) раздражение слабым электрическим током нервных волокон, тогда как нейромодуляция является следствием нервной электростимуляции. Стимуляция слабым электрическим током афферентных волокон соматического отдела периферической нервной системы, идущих в составе различных нервных стволов, но формирующихся преимущественно из третьего сакрального нерва, сопровождается снижением парасимпатической активности тазового нерва и увеличением симпатической активности подчревного нерва. Это приводит к торможению повышенной сократительной активности детрузора. С момента применения первых устройств для электростимуляции до настоящего времени предложено много разновидностей электростимуляции при ГМП. Среди них наиболее эффективными являются афферентная электростимуляция тибиального нерва и сакральная нервная электростимуляция. Однако существуют данные о том, что у больных пожилого возраста (старше 55 лет) эффективность сакральной стимуляции несколько ниже, чем у молодых пациентов [33]. Другим методом лечения ГМП является денервация мочевого пузыря. Для этого используют гидробужирование мочевого пузыря, внутривезикальное введение фенола, капсаицина, резинифератоксина, инъекции ботулинического токсина в стенку детрузора. Хирургические методы, такие как аутоаугментация или кишечная пластика мочевого пузыря, являются последним этапом лечения и применяются при отсутствии эффективности других методов лечения. Таким образом, проблема ГМП и ургентного недержания мочи занимает значительную долю среди заболеваний и причин снижения качества жизни больных пожилого возраста. Ключевым моментом для эффективного лечения больных ГМП является выявление взаимосвязи между симптомами и факторами, не имеющими прямого отношения к мочеполовой системе, такими как сопутствующие заболевания, нарушения двигательной, когнитивной функций и т.д. Лечение таких больных должно проводиться при тесном взаимодействии разных специалистов, включая урологов, гинекологов и терапевтов. При назначении медикаментозного лечения необходимо обращать внимание на уже используемые лекарственные средства по поводу сопутствующих заболеваний. В ряде случаев лечебный эффект может быть достигнут при уменьшении дозы или подборе других лекарственных средств. Для достижения максимального эффекта лечение должно проводиться с учетом имеющихся нарушений двигательной и когнитивной функции. Памперсы и другие паллиативные средства следует использовать в последнюю очередь.

About the authors

E. B Mazo

M. E Shkol'nikov

G. G Krivoborodov

References

Supplementary files