Biopodobnye preparaty: v nachale problemy

Full Text

В 1960–70-е годы благодаря развитию молекулярной биологии была создана методология, позволяющая получать в промышленных объемах идентичные эндогенным высокомолекулярные биологически активные белки человека. Эта методология была основана на выделении или воспроизведении синтетическим путем ДНК, кодирующей требуемую белковую молекулу (кДНК), перенос ее в живые клетки микроорганизмов или млекопитающих и активации гиперсекреции заданного продукта с параллельным наращиванием клеток-продуцентов в больших количествах. Многочисленные методические и технологические подходы к увеличению спектра и качества биомолекул были впоследствии объединены в отдельную научную и производственную область – биотехнологию [1]. В свою очередь появление биотехнологии создало предпосылки для обоснования нового направления в фармакологии, известного сегодня как биофармацевтика, которая в течение короткого промежутка времени позволила достичь существенного прогресса в терапии ряда тяжелых хронических заболеваний и перевести их из разряда неизлечимых в категорию контролируемых. В качестве наиболее ярких примеров можно привести сахарный диабет и другие заболевания, связанные с дефицитом продукции гормонов эндокринопатии, гематологические заболевания, обусловленные снижением количества и функции эритроцитов (анемии) или нарушением в системе свертывания крови (гемофилия), первичные и вторичные иммунодефициты, опухоли разной локализации и др. [2]. За прошедший период несколько десятков биотехнологических препаратов, прошедшие многоцентровые клинические испытания на больших когортах пациентов и претерпевшие ряд серьезных ревизий как со стороны стандартизации и контроля качества производственного процесса, так и оптимизации схем назначения для повышения эффективности и снижения частоты побочных эффектов, прочно утвердились на рынке и стали «золотым стандартом» в лечении этих заболеваний. Вместе с тем в период с 2006 по 2014 г. патентные ограничения на подавляющее большинство оригинальных препаратов прекращают свое действие, что должно неминуемо привести к выходу на рынок многочисленных воспроизведенных биотехнологических лекарственных средств или, как принято их называть, биоподобных препаратов (в Европе – «biosimilars», в США – «follow-on-biologics»). Сам по себе факт расширения спектра препаратов в каждой конкретной медицинской области параллельно со снижением их стоимости, безусловно, можно рассматривать как позитивное событие. Однако в отличие от относительно простых химически синтезируемых лекарственных препаратов, для которых за долгие годы отработаны четкие критерии выхода на рынок аналогов (генериков), биотехнологические препараты имеют ряд особенностей, требующих создания специальных протоколов регистрации их воспроизведенных версий. В настоящее время на основании имеющихся исследований можно с уверенностью утверждать, что биоподобные препараты нельзя отождествлять с химически синтезируемыми генериками [3]. Задача данного обзора – продемонстрировать на конкретных примерах проблемы, возникающие при разработке, производстве и клиническом применении биотехнологических препаратов и их «копий». Среди наиболее значимых из них можно выделить следующие: • сложность структуры действующего вещества; • сложность производства и наличие в технологической цепочке «капризных» живых систем; • несовершенство методов контроля качества высокомолекулярных биотехнологических препаратов; • отсутствие продолжительной клинической «истории» у препарата. Сложность структуры биотехнологических препаратов Молекула одного из самых популярных и простых химически синтезируемых препаратов – ацетилсалициловой кислоты (аспирина), включает 21 атом и имеет массу 180 Да. Молекула одного из самых сложных биотехнологических препаратов – терапевтических моноклональных антител* состоит приблизительно из 25 000 атомов и «весит» около 180 000 Да. Иначе говоря, биотехнологический препарат сложнее химически синтезируемого более чем в 1000 раз, т.е. они отличаются почти так же, как велосипед и современный военный самолет-невидимка [4]. Однако степень отличия биотехнологических и химически синтезируемых лекарственных препаратов не сводится только к разнице в количестве атомов. Как известно, высокомолекулярные белки, помимо определяющей молекулярную массу первичной структуры (последовательность аминокислот), имеют вторичную, третичную и четвертичную (пространственная организация). В процессе синтеза белковых молекул одни и те же аминокислотные последовательности могут трансформироваться за счет сплайсинга и внутримолекулярных сшивок (разрезание цепи и повторное сшивание фрагментов, например, дисульфидными связями), присоединения разных группировок (гликозилирование, фосфорилирование, γ-карбоксилирование) и/или олигомеризации (образование многомерного комплекса из нескольких идентичных молекул через ионные связи). Любые минимальные изменения как в первичной последовательности белка, так и в его пространственной организации трудно предсказуемы в условиях биотехнологического производства и, как правило, отражаются на фармакологической активности конечного продукта. Еще больше осложняют стандартизацию биотехнологического производства идущие параллельно с синтезом процессы деградации (ферментативной, свободнорадикальной и др.), которые приводят к образованию продуктов с практически идентичной препарату массой и даже пространственной организацией, но с другой биологической активностью. Одним из наиболее иллюстративных примеров зависимости фармакологической эффективности от минимальных изменений в первичной структуре могут служить препараты инсулина. Этот гормон был первым биотехнологическим продуктом, который, начиная с 1982 г., использовался как лекарственный препарат для заместительной терапии при диабете и остается наиболее «простым» в мире биофармацевтических лекарственных средств (51 аминокислота, молекулярная масса 5808 Да, негликозилирован, не имеет изоформ). До эры рекомбинантных белков для лечения сахарного диабета применяли животные аналоги инсулина, полученные или из крупного рогатого скота (бычий), или из свиней. По первичной структуре человеческий и бычий инсулины отличаются на 3, а человеческий и свиной – только на 1 аминокислоту. В результате многочисленных исследований (в том числе многоцентровых с уровнем доказательности А) продемонстрировано, что профиль безопасности высокоочищенного свиного инсулина сравним с аналогичным показателем для рекомбинантного гормона человека, тогда как бычий инсулин при многократном введении вызывает выработку нейтрализующих антител и резкое снижение эффективности препарата (не считая высокой частоты анафилактических реакций, прямо пропорциональной степени очистки бычьего гормона). Таким образом, разница всего в 2 аминокислоты (4% первичной структуры) приводит к фатальному изменению безопасности препаратов инсулина [1]. Еще более неожиданные результаты получены в ходе доклинических испытаний модифицированных рекомбинантных инсулинов человека. Так называемое второе поколение разрабатывалось компаниями с целью изменения фармакокинетики и оптимизации терапии за счет создания быстро и длительно действующих форм гормона. Изменения скорости действия и метаболизма гормона пытались добиться за счет единичных замен аминокислот в первичной структуре инсулина. Этот методический подход оправдал себя, и было получено несколько вариантов эффективных быстродействующих препаратов. Однако при замещении гистидина в положении 10 β-цепи инсулина на аспарагиновую кислоту наряду с увеличением скорости гипогликемического действия у экспериментальных животных наблюдалось проонкогенное действие препарата. Индукция и усиление роста опухолей, очевидно, были связаны с повышением сродства модифицированного гормона к рецепторам инсулиноподобных факторов роста, длительная стимуляция которых является одним из пусковых механизмов злокачественной трансформации клеток. Напротив, вариант с заменой пролина в положении 28 β-цепи на аспарагиновую кислоту оказался удачным и позволил достичь желаемого эффекта без дополнительного проонкогенного воздействия (см. рисунок). При этом данные двух вариантов модифицированного инсулина отличались по массе всего на 0,7% (40 Да), что находится на границе разрешения рутинных методов анализа структуры белка [5]. Исследования разных вариантов другого биотехнологического препарата – эритропоэтина, могут стать иллюстрацией того, насколько сложно бывает воспроизвести вторичную и третичную структуру белка. В отличие от инсулина эритропоэтин представляет собой гликозилированный белок, который синтезируется почками в виде набора изоформ, отличающихся по трехмерной структуре, физико-химическим свойствам и по биологической активности. Первый препарат рекомбинантного эритропоэтина (эпоэтин-α) был разработан в середине 1980-х годов прошлого столетия и в настоящее время во многих странах существуют его биоаналоги, большая часть которых при выходе на рынок регистрировалась по стандартам, принятым для химически синтезируемых генериков (т.е. без полноценных клинических испытаний с оценкой только биоэквивалентности аналога оригинальному препарату). Комплексная сравнительная оценка состава разных биоаналогов эритропоэтина, проведенная в двух исследованиях, дала неутешительные результаты (табл. 1). В первое исследование были включены 11 продуктов, производимых в Корее, Аргентине, Китае и Индии [6], во второе, более масштабное, – уже 47 биоаналогов эритропоэтина из 16 стран, включая Россию [7]. И химический состав, и биологическая активность практически всех изученных биоаналогов существенно отличались от референсного препарата. Особо обращают внимание выявленные различия между партиями одного и того же биоаналога по количеству действующего вещества, превышение нормативов по содержанию агрегатов белка и наличие в отдельных образцах липополисахарида (эндотоксина). Это свидетельствует о нарушениях в производственном процессе и отсутствии адекватного контроля качества продукции. Сложность производства и «капризы» живых систем Еще одной особенностью немодифицированных биотехнологических препаратов является невозможность патентования действующего вещества. При полном совпадении структуры лекарственного препарата и эндогенного белка человека защита формулы не рентабельна, так как она является общественным достоянием, поэтому в большинстве случаев инновационные компании патентуют технологический процесс, лежащий в основе производства. При этом в стремлении перекрыть все возможные усилия конкурентов технология патентуется в общем виде без указания важных для производства качественного продукта ключевых позиций и так называемых реперных точек. После окончания срока патентных ограничений компании, специализирующиеся на производстве биоподобных препаратов, вынуждены начинать с чистого листа и заново проходить весь путь, совершая те же ошибки [8]. В целом процесс производства биотехнологических препаратов можно разделить на шесть этапов: • синтез кДНК действующего вещества; • подбор вектора для трансфекции и соединение его с кДНК; • подбор клеток-продуцентов и модификация их генома с помощью полученной конструкции вектор-кДНК (трансфекция); • наращивание трансфицированных клеток-продуцентов и получение супернатанта, содержащего биотехнологический продукт; • очистка препарата с использованием высокоэффективных биохимических методов; • создание лекарственной формы (стабилизация, упаковка, стандартизация по дозировке). Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что точно повторить любой из перечисленных этапов производства биотехнологического препарата, не зная протокола, практически невозможно (табл. 2) [9]. Более того, даже при наличии протоколов центральную роль в производстве биотехнологических препаратов играют живые системы (клетки микроорганизмов или млекопитающих), «капризность» которых остается существенной проблемой как в научных исследованиях, так и в биотехнологическом производстве. При минимальных отклонениях технологии производства «неуправляемость» продуцентов может стать источником изменения характеристик даже оригинальных и хорошо зарекомендовавших себя биотехнологических препаратов, не говоря уже о воспроизведении с листа нового технологического цикла для их «копий». Рассмотрим несколько примеров. В целях повышения эффективности производства компания-разработчик инновационного препарата – фактора свертывания крови VII, приняла решение заменить линию клеток-продуцентов: вместо почечных фибробластов (линия ВНК) было предложено использовать клетки яичников (линия СНО). Эта замена должна была привести к увеличению выхода продукта и оптимизации процедуры его очистки. Однако, как оказалось, у клеток этих двух линий существовали принципиальные различия в гликозилировании секретируемых белков. Отличия в гликозилировании отразились на фармакокинетике ВНК- и СНО-продуктов (до 30% расхождения в площадях под кривой «концентрация–время»). В ответ FDA* потребовала у компании предоставить новое регистрационное досье на модифицированный препарат и заново провести клинические испытания [10]. Другая неудачная история «улучшения» производства оригинального биотехнологического препарата связана с рекомбинантной человеческой кислотой α-гликозидазой. Этот фермент предназначен для заместительной терапии у пациентов с болезнью Помпе – врожденным гликогенозом 2-го типа. Очевидно, изначально компания-разработчик переоценила объем рынка препарата и наладила его производство в 2000-литровом реакторе. Последующий переход на 160-литровый реактор неожиданно привел к изменению точек гликозилирования и потребовал разработки нового протокола очистки продукта. Как и в предыдущем случае, FDA признала серии препарата, произведенные в разных объемах, разными продуктами, потребовала отдельное регистрационное досье на 160-литровый препарат и рекомендовала выпускать 160- и 2000-литровые продукты под разными торговыми названиями [3]. Несовершенство методов контроля качества биотехнологических препаратов За время развития современной биохимии и молекулярной биологии разработано несколько десятков методов, позволяющих детально охарактеризовать первичную, вторичную и даже третичную структуру белка. Сиквиенс дает возможность выявить отличия в одну аминокислоту между двумя белками с молекулярными массами в несколько десятков или сотен тысяч дальтон. Зная последовательность аминокислот, можно с высокой достоверностью рассчитать вероятные точки его гликозилирования, сульфатирования, фосфорилирования и других посттрансляционных модификаций. Наконец, рентгеноструктурный анализ и ядерно-магнитный резонанс позволяют воссоздать трехмерную модель белка и представить, как он «ощущает» себя в пространстве и на что он «способен». Несмотря на это, в биофармацевтике бытует мнение, что химическая идентичность двух лекарственных препаратов-белков не гарантирует их равную терапевтическую эффективность [11]. Данное, на первый взгляд абсурдное, мнение основано на фактах, согласно которым современные общепринятые методы анализа структуры белков оказывались бессильными в интерпретации различий биотехнологических препаратов при их клиническом использовании (т.е. действующие вещества идентичны, а эффекты отличаются). Это, с одной стороны, свидетельствует об отсутствии гарантии выявления рутинными методами различий между оригинальным препаратом и его «копией», а с другой – диктует необходимость внедрения более чувствительных аналитических процедур, причем с учетом особенностей каждого биотехнологического продукта. Недавно был рассеян миф о том, что оригинальный препарат гормона роста (соматотропин) и некоторые его «копии» различаются в показателях фармакокинетики и фармакодинамики при абсолютной структурной идентичности! Для этого понадобились фундаментальные исследования с использованием новейших аналитических методов, посвященные посттранляционным модификациям и путям деградации соматотропина в норме и при ряде патологических состояний. В результате авторы обнаружили новую изоформу гормона с тиоэфирной связью Cys182–Cys189, которая формируется при температуре около 40оС и высоких значениях рН. Наличие в препарате соматотропина этой связи приводит к снижению его взаимодействия с рецептором и падению биологической активности. Дальнейший сравнительный анализ показал, что в референсном препарате гормона в отличие от пяти его «копий» (соответствующих регистрационным требованиям Евросоюза и США) тиоэфирные связи Cys182– Cys189 не выявляются. В биоподобных препаратах содержание тиоэфирной изоформы составляло 5–32% и варьировало от серии к серии (что гораздо хуже) [12]. Таким образом, несмотря на заявления фирм-производителей «копий», препараты не имели абсолютную структурную идентичность, что было выявлено только с использованием дополнительных методов анализа. Отсутствие клинической «истории» у препарата: иммуногенность Подводя промежуточный итог представленному выше материалу, хотелось бы отметить, что сложность структуры биотехнологических лекарственных средств и связанные с ней проблемы стандартизации производства и несовершенства методов анализа конечного продукта оставляют лишь одну возможность для выхода на рынок безопасных и эффективных биоподобных препаратов – проведение их полномасштабных клинических испытаний. При этом главной особенностью этих испытаний являются специальные протоколы, направленные на оценку иммуногенности. Среди всех побочных эффектов биотехнологических лекарственных средств иммуногенность занимает центральное место, так как развитие иммунного ответа против действующего вещества «неудачного» препарата может приводить не только к инактивации его самого, но и большинства его «копий», а также эндогенного белка, что неминуемо вызывает утяжеление заболевания. При этом доклиническая оценка иммуногенности тех или иных биотехнологических продуктов имеет существенные сложности. Так, испытания на животных затруднены межвидовыми различиями, которые обусловливают потенциальную иммуногенность любых белков человека в ксеногенных системах, а модельный математический анализ антигенных эпитопов, потенциально значимых для выработки нейтрализующих антител, дает лишь вероятностный результат [13]. В настоящее время описано два варианта индукции нейтрализующего иммунного ответа против биотехнологических препаратов. В первом случае развитие ответа связано со структурными трансформациями самого действующего вещества (наиболее часто – минимальные отклонения в пространственной организации белка или изменение его агрегатного состояния в процессе приготовления лекарственной формы). Во втором случае оно связано с наличием в препарате примесей (как правило, фрагментов клеток-продуцентов), которые выполняют роль адъювантов и через сигнальные рецепторы врожденного иммунитета индуцируют повышенную готовность адаптивного иммунитета и его агрессию против собственных белков, включая действующее вещество биотехнологического препарата. Иллюстрацией первого варианта может стать эпизод, связанный с изменением состава оригинального препарата эритропоэтина. Учитывая риск эпидемии «коровьего бешенства», производитель был вынужден заменить в препарате наполнитель – человеческий сывороточный альбумин на смесь полисорбата и глицина. Точная причина произошедшего дальше остается неясной, но наиболее вероятна версия, согласно которой смена наполнителя вызвала изменение агрегатного состояния (мицелирование) эритропоэтина. В результате в течение пяти последующих лет количество больных с полной аутоиммунной анемией, индуцированной новой версией препарата, достигло 250 человек. Компании заново пришлось проводить полную ревизию производства вплоть до замены пробок на флаконах и дополнительные испытания иммуногенности препарата [14]. Другой пример, отражающий способность примесей индуцировать иммунный ответ против действующего вещества, касается одного из аналогов соматотропина. При длительном применении первой версии этого препарата у 57% пациентов были выявлены антитела к гормону роста. Исследование причин иммуногенности показало наличие в его составе следовых количеств белков клеток-продуцентов. Был заново разработан процесс очистки, повторно проведены клинические исследования. Сывороточный уровень антител к соматотропину при назначении второй версии биоподобного препарата значительно снизился. Только после этого препарат был одобрен в Европе и США [15]. Заключение, или что делать дальше? Анализ приведенных в этом обзоре и многих других подобных примеров демонстрирует необходимость детального и специализированного подхода к регистрации биоподобных препаратов, который исключает автоматический перенос упрощенных требований, принятых для химически синтезируемых генериков. Эта необходимость признана в Евросоюзе. Европейским медицинским агентством разработан не только включающий клинические испытания общий протокол для любого биоподобного препарата, но и четыре отдельные инструкции для наиболее часто воспроизводимых биотехнологических лекарственных препаратов (инсулины, соматотропин, эритропоэтин, колониестимулирующие факторы) [16]. В завершающей стадии находятся аналогичные документы в США [17]. Еще 11 стран (включая Японию, Канаду, Австралию и Израиль) или уже приняли соответствующие поправки в законодательство, или движутся по пути к этому. К сожалению, ужесточение регистрационных требований к биоподобным препаратам снижает значимость экономического фактора: проведение полномасштабных клинических испытаний в совокупности с использованием последних достижений в области контроля качества производства не позволит уменьшить стоимость воспроизведенных биотехнологических лекарственных препаратов более чем на 15–30%. Однако, как мне кажется, не стоило вкладывать огромные интеллектуальные и материальные ресурсы в биотехнологию, для того чтобы некачественные биоподобные препараты отбросили нас на десятилетия назад в лечении самых трудных и опасных заболеваний.

About the authors

I. G Kozlov

References

Supplementary files