Features of the spectrum and the concentration of the products of purine and pyrimidine metabolism in thrombolytic therapy in patients with ischemic stroke

Full Text

Введение Ишемический инсульт (ИИ) является в настоящее время одной из наиболее значимых медицинских и социальных проблем в связи со значительной частотой его развития, высоким процентом неблагоприятных клинических и функциональных исходов [1-3]. При этом наиболее безопасный и эффективный метод реперфузионной терапии при ИИ в первые 4,5 ч от начала развития симптоматики - это тромболитическая терапия (ТЛТ), которая нередко сопровождается разными осложнениями [4, 5]. Понимание тонких механизмов ишемического повреждения ткани головного мозга (ГМ) при ИИ необходимо для адекватной диагностики, терапии и прогнозирования исхода заболевания. Нарушения энергетического метаболизма как первая реакция ткани мозга на ишемию характеризуются изменением спектра пуриновых и пиримидиновых соединений, которые входят в состав макроэргических соединений и их метаболитов. В настоящее время в ряде исследований показана взаимосвязь между изменением обмена некоторых азотистых оснований и реакциями в ишемизированной ткани ГМ [6-9], тогда как данные об особенностях пуринового и пиримидинового метаболизма у больных с ИИ при проведении ТЛТ, а также исследования по изучению спектра и динамики концентраций предшественников и продуктов метаболизма азотистых оснований у таких пациентов в литературе отсутствуют. Целью настоящей работы стало определение спектра и концентраций продуктов пуринового и пиримидинового обмена у больных с ИИ до проведения ТЛТ. Материалы и методы В исследование были включены 24 пациента (18 мужчин и 6 женщин) с полушарным ИИ, подтвержденным методами нейровизуализации, поступивших в нейрореанимационное отделение ГБУЗ «Городская клиническая больница №31» Департамента здравоохранения г. Москвы за 2008-2009 гг. Критерии включения и исключения из исследования были основаны на российских и зарубежных методических рекомендациях по проведению ТЛТ [10, 11]. Всем больным при поступлении в стационар выполняли компьютерную томографию (КТ) ГМ. С целью изучения динамики очага поражения, а также для исключения развития геморрагической трансформации (ГТ) повторное КТ- исследование ГМ выполняли на следующий день в случае проведенной ТЛТ. Подтвержденная КТ-исследованием ГТ считалась симптомной, если она привела к клиническому ухудшению (повышению оценки по шкале NIHS - National Institutes of Health Stroke Scale на 4 балла и выше) или смерти и была идентифицирована в качестве основной причины ухудшения неврологического статуса [11]. Степень выраженности неврологической симптоматики оценивали по шкале инсульта NIHS [12]. Также всем пациентам проводили электрокардиографическое исследование, рентгенографию органов грудной клетки, ультразвуковое исследование брахиоцефальных сосудов и сердца. Продолжительность наблюдения в стационаре составила 24,6±10,8 дня. Возраст больных - 65,5 (50,5; 71,8) года; тяжесть инсульта при поступлении по шкале NIHS - 17,5 (11,3; 20) балла. Объем очага поражения составил 30 (4; 119; n=13) см3. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1. Следует отметить, что в выборке статистически значимо преобладали мужчины (75%) с тяжелым атеротромботическим левосторонним ИИ (р=0,050). Наиболее часто встречающиеся у пациентов сопутствующие заболевания представлены в табл. 2. Схема лечения включала в себя максимально унифицированную базисную и антитромботическую терапию. Также всем пациентам был проведен системный тромболизис рекомбинантным тканевым активатором плазминогена (rt-PA). В качестве критериев прогнозирования были выбраны следующие исходы/осложнения ИИ за период нахождения больных в стационаре (табл. 3): летальный исход (ЛИ) - 5 (20,8%) пациентов; отсутствие ЛИ - 19 (79,2%); нелетальная ГТ - 12 (50%; ГТ без ЛИ). Число пациентов без указанных исходов/осложнений (БО) составило 12 (50%) человек. Наиболее обширные очаги поражения были зафиксированы у больных с ЛИ; в среднем на 28,8 см3 менее - у пациентов с ГТ без ЛИ; наименьшие - у больных с ИИ БО, что подтверждает взаимосвязь объема очага поражения с исходом ИИ. Большая степень тяжести ИИ по шкале NIHS наблюдалась у пациентов с осложнениями по сравнению со случаями ИИ БО в исходе, что также свидетельствует о корреляции между тяжестью ИИ и оценкой по шкале NIHS. В 1/2 всех случаев как осложнение ИИ развилась ГТ очага поражения. Лабораторные исследования помимо стандартных исследований крови и мочи включали в себя определение спектра и концентраций 18 соединений, участвующих в обмене пуринов и пиримидинов в сыворотке венозной крови до ТЛТ. Для определения спектра и концентраций соединений, участвующих в обмене пуринов и пиримидинов, венозную кровь стабилизировали в пробирках с активатором свертывания (SiO2) и разделительными гранулами, путем центрифугирования на 3000 об/мин в течение 10 мин получали сыворотку, к которой добавляли 5мМ ацетата аммония, смесь переносили на фильтр Millipore. После фильтрования проводили исследование сыворотки методом тандемной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) на анализаторе «Agilent 6410» (6410 Triple Quadrupole LC/MS; США). Разделение веществ по 18 пуриновым и пиримидиновым основаниям производилось градиентным элюированием, использовалась обращеннофазная хроматографическая колонка ZORBAX Eclipse XDB-C18, 5 μм, 4,6¥150 мм («Agilent», США). Статистическая обработка данных исследования проведена с использованием программного обеспечения SPSS18.0 и Microsoft Excel 2010. Параметрические и непараметрические методы представления и сравнения использовались в зависимости от нормальности распределения. Значение вероятности (р) менее 0,05 (двухсторонняя проверка значимости) демонстрировало статистическую значимость. Анализ рисков проводился методом латинского квадрата с расчетом отношения шансов и дополнительных рисков. Характеристики качественных или пороговых критических значений количественных переменных (чувствительность, специфичность, точность, правдоподобие) оценивались с применением таблицы сопряженности. Точность количественных переменных оценивалась рабочей характеристической кривой (ROC-кривой), площадь под которой показывает точность теста при разных точках деления и не зависит от преваленса заболевания. Выбор точек деления подтверждался оценкой значимости расхождения концентрационных кривых Каплана-Мейера по преваленсу заболевания. Факторный анализ проводился методом главных компонент корреляционной матрицы с учетом веса компонента более 1 и векторного влияния переменной в факторном комплексе (fr) [13]. Результаты Особенностью спектра пуриновых и пиримидиновых оснований у больных с ИИ до проведения ТЛТ являлось отсутствие или наличие в следовых количествах (≤0,0001 мкмоль/л) аденина, гуанина, цитидина, тимина, тимидина, урацила, дигидроурацила и гидроксиметилурацила. Особенностью спектра пуриновых и пиримидиновых оснований группы ЛИ до ТЛТ стало отсутствие аденозина, дезоксиаденозина, ксантина (рис. 1). Концентрация оротовой кислоты в группе БО была статистически значимо ниже в 94 раза, чем в группе с ЛИ (р=0,043); в 63 раза, чем в группе ГТ без ЛИ (р=0,057), и в 56 раз, чем в группе пациентов без ЛИ (р=0,043); рис. 2. Многофакторный анализ показал наличие сильной взаимосвязи концентрации оротовой кислоты с нелетальной ГТ (fr=0,787) и взаимосвязи средней силы с ЛИ (fr=0,468). С целью уточнения диапазона концентраций оротовой кислоты, наиболее значимых в прогнозе исходов ИИ, определены пороговые значения указанной переменной с использованием характеристических кривых, кривых Каплана- Мейера и расчетом характеристик критических пороговых значений. В прогнозе выживаемости наибольшее расхождение кривых приходилось на значение 2,29 мкмоль/л с чувствительностью 84,2% и специфичностью 80% (рис. 3, 4). Относительный шанс выживаемости при концентрации оротовой кислоты более 2,29 мкмоль/л составил 2,20; относительный риск ЛИ при концентрации оротовой кислоты менее 2,29 мкмоль/л - 21,3. Пороговые значения концентрации оротовой кислоты в прогнозе ГТ без ЛИ по характеристической кривой составили 60,1 и 90,6 мкмоль/л, но наибольшее расхождение кривых пришлось на значение 90,6 мкмоль/л (рис. 5, 6). Относительный риск ГТ без ЛИ при концентрации оротовой кислоты более 90,6 мкмоль/л составил 2,28; отношение рисков - 4,20. Прогностическая ценность отрицательного результата - 87,5%; чувствительность - 60,0%; специфичность - 73,7%. Обсуждение Выявленные особенности спектра соединений у больных с ЛИ в точке до проведения ТЛТ в виде отсутствия или наличия следовых количеств аденозина, дезоксиаденозина и ксантина свидетельствуют об исходном значительном отличии обмена азотистых оснований в указанной группе по сравнению с группами выживших пациентов. Известно, что аденозин входит в состав аденозитрифосфата (АТФ) и нуклеиновых кислот, играет важную роль в процессах передачи энергии (АТФ и аденозиндифосфат) и сигналов (циклический аденозинмонофосфат). В ответ на повреждение клетки (в воспаленных или ишемизированных тканях) концентрация аденозина возрастает. Таким образом, в ответ на стресс аденозин проявляет цитопротекторное действие, защищая ткани от повреждения в случаях гипоксии, ишемии. В данной работе было показано, что состояние пациентов с ЛИ при поступлении в стационар было исходно тяжелее, чем состояние больных без ЛИ (больший возраст, тяжесть инсульта по шкале NIHS, размеры объема очага поражения, показатели артериального давления, наличие сопутствующих заболеваний), и во многом определило метаболический профиль до наступления сосудистой катастрофы. Можно предположить, что отсутствие аденозина и дезоксиаденозина, являющегося продуктом его метаболизма, в спектре азотистых оснований у пациентов с ЛИ характеризует глубокие и длительные нарушения энергетического обмена. У пациентов с ЛИ до ТЛТ в спектре азотистых оснований отсутствует ксантин. Ксантин является продуктом катаболизма пуринов, образуется как продукт распада гуанина под действием гуаниндезаминазы и при окислении гипоксантина под действием ксантиноксидазы. Некоторыми авторами было выявлено, что при тяжелой гипоксии угнетен катаболизм пуринов за счет снижения активности ксантиноксидазы [14]. Таким образом, с одной стороны, при недостаточной активности ксантиноксидазы может не происходить окисление гипоксантина с накоплением ксантина, а также гуанина как исходного вещества. Однако следует учесть длительность гипоксического повреждения тканей у больных с ЛИ и повышенное содержание у них мочевой кислоты - конечного продукта распада пуринов. Усиление распада пуриновых оснований, сопряженное с активацией апоптоза и свободно-радикального окисления вследствие длительности гипоксического повреждения тканей у пациентов с ЛИ, отражает общую тяжесть состояния организма и в итоге объясняет отсутствие в сыворотке ксантина. На основании полученных данных и проведенного статистического анализа установлено, что концентрация оротовой кислоты в острейшем периоде ИИ ассоциирована с исходами/осложнениями ТЛТ - нелетальной ГТ и ЛИ. Пороговое значение концентрации оротовой кислоты в прогнозе выживаемости составило 2,29 мкмоль/л. Концентрация оротовой кислоты выше 90,6 мкмоль/л ассоциирована с риском развития нелетальной ГТ. Оротовая кислота участвует в биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов в качестве их предшественника. Отмечено, что данное соединение является стимулятором обменных процессов, синтеза нуклеиновых кислот, усиливает репаративные и регенеративные процессы, образование альбуминов в печени, особенно в условиях длительной гипоксии, а также участвует в синтезе метионина, обмене фолиевой и пантотеновой кислот. Биосинтез оротовой кислоты осуществляется из аспарагиновой кислоты и является АТФ-зависимым. На одном из этапов синтеза происходит дегидрогенирование дигидрооротовой кислоты с использованием никотинамидаденин-динуклеотида (NAD) в качестве кофактора и образованием оротовой кислоты. В условиях гипоксического повреждения тканей ингибируется NAD/NADH-зависимый путь (NADH - восстановленный никотинамидаденин- динуклеотид) окисления, накапливается NADH и как следствие - увеличивается уровень восстановленных форм пиридин-нуклеотидов, наступает «субстратный голод». Кроме того, активность дигидроротат-дегидрогеназы (фермента, катализирующего реакцию дегидрогенирования) также зависит от содержания кислорода. Таким образом, снижение концентрации оротовой кислоты у больных с ЛИ может отражать нарастание уровня гипоксии, интенсификацию свободно- радикального окисления и апоптоза. Повышение концентрации оротовой кислоты у выживших больных, вероятно, способствует меньшей выраженности гипоксического повреждения тканей, активации обменных и регенерационных процессов. Заключение Таким образом, особенностью спектра пуриновых и пиримидиновых оснований у пациентов с ЛИ в острейшем периоде ИИ до проведения ТЛТ является отсутствие таких соединений, как аденозин, дезоксигуанозин, ксантин. Концентрация оротовой кислоты в острейшем периоде ИИ ассоциирована с исходами ТЛТ - нелетальной ГТ и ЛИ. Концентрация оротовой кислоты менее 2,29 мкмоль/л была ассоциирована с риском развития ЛИ, а выше 90,6 мкмоль/л - с наличием нелетальной ГТ, т.е. высокой вероятностью выживания. Конфликт интересов и источники финансирования написания данной статьи отсутствуют.

About the authors

O. V Lyang

N.I.Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: o.lyang@fedlab.ru
117997, Russian Federation, Moscow, ul. Ostrovitianova, d. 1

V. N Fedorov

N.I.Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

117997, Russian Federation, Moscow, ul. Ostrovitianova, d. 1

A. G Kochetov

N.I.Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

117997, Russian Federation, Moscow, ul. Ostrovitianova, d. 1

N. A Shamalov

N.I.Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

117997, Russian Federation, Moscow, ul. Ostrovitianova, d. 1

L. V Stakhovskaya

N.I.Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

117997, Russian Federation, Moscow, ul. Ostrovitianova, d. 1

References

Supplementary files