Pathogenetic features of contamination of the esophagus mucosa in gastroesophageal reflux disease

Full Text

Согласно последним эпидемиологическим данным в мире отмечается неуклонный рост распространенности кислотозависимых заболеваний желудочно-кишечного тракта, среди которых лидирующие позиции занимает гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) [1]. Актуальность большинства исследований, посвященных данной проблеме, обусловлена значительным снижением качества жизни пациентов с ГЭРБ и высокими рисками осложненного течения [2]. Так, длительная экспозиция и агрессивный характер рефлюктата приводят к эрозивно-язвенным поражениям слизистой оболочки пищевода (СОП) и развитию таких грозных осложнений, как пептическая стриктура пищевода, кровотечения, пищевод Барретта (ПБ) [3]. Современные представления о ГЭРБ как о кислотозависимом заболевании формализуют применение в качестве базисных препаратов с кислотосупрессивным эффектом. Однако при этом резистентность к такой медикаментозной терапии составляет от 10 до 40%, что, по мнению S.Jürgens и соавт. (2012 г.), связано с особенностями состава гастроэзофагеального рефлюктата [4]. Кроме этого, хорошо известно, что результат влияния патологического рефлюкса на СОП также определяется длительностью воздействия и собственной резистентностью слизистой пищевода. Установлен высокий деструктивный потенциал кислого характера рефлюктата, отличающийся от щелочного механизмами повреждения СОП [3, 5]. Впервые повреждающее действие щелочного рефлюкса описано в работе F.Сross и соавт. (1951 г.) [6], где было показано, что желчные кислоты в рефлюктате приводят к эрозивному эзофагиту. Более того, ряд клинических исследований [7-9] подтвердил роль щелочного рефлюктата в формировании резистентного течения ГЭРБ, развитии метаплазии эпителия ПБ с последующей трансформацией в аденокарциному пищевода. При этом установлено, что в основе патогенетического механизма токсического действия желчных кислот на СОП лежит модуляция процессов апоптоза, пролиферации, клеточной дифференцировки и синтеза воспалительных цитокинов [7, 9]. Так, под воздействием щелочного рефлюктата происходят повреждение ДНК эпителиоцитов пищевода с последующим нарушением регуляции генов, вовлеченных в их цилиндрическую и/или плоскоклеточную дифференцировку, а также синтез оксида азота, который, в свою очередь, снижая экспрессию изоформ p53, способствует стратификации плоского эпителия и увеличивает экспрессию CDX2 - фактора интестинальной дифференцировки. Именно таким образом, по мнению M.Abdel-Latif (2016 г.), рефлюкс дуоденального содержимого запускает перепрограммирование в экспрессии ключевых факторов транскрипции и процесс трансдифференцировки [10]. Установлено, что у пациентов с верифицированным ПБ длительная экспозиция желчных кислот в пищеводе генерирует свободные радикалы и активирует NF-κB, инициируя неконтролируемый апоптоз в отношении неповрежденной СОП [11]. Однако фрагментарность исследований роли характера рефлюктата в патогенезе заболевания диктует поиск инновационных методик, направленных на детализацию молекулярных механизмов влияния биологических жидкостей с различным рН на СОП, структуру протеома и состояние межклеточных контактов. К современным биоинформационным возможностям можно отнести протеомное профилирование и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии E-кадгерина. Целью нашей работы явилось изучение у больных с ГЭРБ протеомного паттерна и экспрессии Е-кадгерина в СОП в зависимости от состава патологического гастроэзофагеального рефлюктата. Настоящее исследование выполнено в период с 2016 по 2017 г. на базе консультативно-диагностической поликлиники и гастроэнтерологического отделения клиники ФГБОУ ВО РостГМУ, медицинского центра «Новомедицина» (г. Ростов-на-Дону). На I этапе проводилось комплексное клиническое обследование по стандартному протоколу для пациентов с ГЭРБ [1]. Диагноз верифицирован с использованием клинико-анамнестических данных, инструментальных методов обследования, включающих: видеоэзофагогастродуоденоскопию с детальным осмотром дистального отдела пищевода в режиме NBI, хромовидео-эзофагоскопию с витальным красителем (4% раствор Люголя), биопсией и морфологическим исследованием эзофагобиоптатов; 24-часовую внутрипищеводную pH-импедансометрию. Критериями включения пациентов в исследование являлись: амбулаторные и стационарные больные с диагнозом ГЭРБ и ПБ в возрасте от 18 до 55 лет, ограничение приема антисекреторных препаратов в течение 1 мес. Ранжирование больных проводилось в зависимости от результатов 24-часовой внутрипищеводной pH-импедансометрии, демонстрирующих особенности преобладающего характера рефлюктата. Сформированы две исследовательские когорты больных: 1-я группа - 39 пациентов (16 женщин и 23 мужчины, средний возраст 48,2±14,3 года) с кислым и слабокислым характером рефлюктата, 2-я группа - 25 больных (11 женщин, 14 мужчин, средний возраст 43,2±12,2 года) с щелочным и слабощелочным рефлюксом. В 1-й группе преобладали пациенты с градацией эрозивного эзофагита А и В, во 2-й доминировали больные с эрозивным эзофагитом градации С, D и ПБ (Лос-Анджелесская классификация рефлюкс-эзофагита, 1994). Группу сравнения составили 20 здоровых добровольцев. На II этапе осуществлялось протеомное и ИГХ-исследование эзофагобиоптатов, полученных в ходе эндоскопического исследования из дистальной части пищевода. Для предварительного фракционирования образцов СОП использовали стандартные наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с различными поверхностями MB-HIC C8, MB-IMAC Cu, MB-WСХ, согласно методике производителя (Bruker Daltonics, Германия). Подготовка к проведению масс-спектрометрического анализа состояла в следующем: элюаты наносили на стальную мишень AnchorChipTM, после высушивания на воздухе образец покрывали раствором матрицы. В качестве последней использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной и α-цианогидроксикоричной кислот в смеси метанол/ацетонитрил/вода (5:4:1). Масс-спектры получали с использованием тандемного MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) масс-спектрометра Ultraflex II (Bruker Daltonics, Германия). Спектры калибровали с помощью внешних стандартов, представляющих смесь белков и пептидов с известными массами (Bruker Daltonics, Германия). Каждый масс-спектр был проанализирован программами FlexAnalysis 3.0 и ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Идентификацию белков и пептидов проводили путем поиска соответствующих кандидатов в базах данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) и Swiss-Prot/UniProt с использованием программы Mascot Search (v 2.1, Matrix Science, Великобритания). Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс-покрытия не менее 60%. ИГХ-исследование эзофагобиоптатов осуществлялось по стандартной методике стрептавидин-биотиновым методом с использованием моноклональных мышиных антител к Е-кадгерину (Dako, США). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере с рН 6,0. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Маейра в течение 15-60 с. Оценка интенсивности экспрессии молекул Е-кадгерина дана полуколичественным методом (от 0 до 3 баллов) в различных эпителиальных структурах: в многослойном плоском эпителии, покровном эпителии железистого типа, зонах кишечной метаплазии [12]. Для статистического анализа полученных данных использовался пакет модулей программы Statistiсa 10.0 for Windows (StatSoft, США). Величины, подчиняющиеся нормальному распределению, представлены в виде выборочного среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m). Величины, не подчиняющиеся нормальному распределению, описывались медианой (Me), нижней (Q 0,25) и верхней (Q 0,75) квантилью, минимальным (Min) и максимальным (Max) значениями. Проверка распределений на соответствие нормальному закону проводилась на основе критерия Колмогорова-Смирнова. Во всех процедурах статистического анализа пороговый уровень значимости различий принят р=0,05. У больных с ГЭРБ выделены и типированы девять протеинов, ответственных за формирование цитоскелета и пролиферацию эпителиоцитов, а также участвующих в сложных каскадах воспалительных процессов в СОП (табл. 1). При сопоставлении протеомного профиля СОП больных с ГЭРБ и здоровых волонтеров совпадений белкового профиля не выявлено. Результаты анализа протеомного паттерна в зависимости от характера патологического рефлюктата показали, что в группе пациентов с преимущественно кислым рефлюксом зарегистрирована экспрессия трех белков: винкулин, кальпонин-1, цистатин C (табл. 2). Винкулин (vinculin) - актинсвязывающий белок, преимущественно локализующийся в области кадгеринопосредованных межклеточных соединений и интегриновых рецепторов клеточной мембраны. Белок играет ключевую роль в формировании фокальной адгезии, пролиферации клеток и регуляции актин-цитоскелета. Ранее B.Lifschitz-Mercer и соавт. (1997 г.) установили, что белок играет протективную роль при повреждении, его повышенная экспрессия связана с нарушением целостности слизистой пищевода, а ее снижение зарегистрировано при аденокарциноме пищевода [13]. Кальпонин-1 (calponin-1) является основным белком гладкомышечных клеток, обеспечивающим стабильность цитоскелета. Цистатин С - член ингибиторов цистеиновых протеаз, снижает активность катепсина В, тем самым предотвращая глубокое повреждение слизистой оболочки. Таким образом, основным механизмом повреждающего действия кислого рефлюктата является нарушение целостности цито-скелета. В клинических исследованиях C.Legendre и соавт. (2014 г.), J.Phelan и соавт. (2016 г.) продемонстрировано, что в основе патологического воздействия желчных кислот на СОП лежат процессы гипоксии, сопровождающиеся экспрессией белка-1, стимулируемого гипоксией, прихибитина-2, тиоредоксина [14, 15]. Нами получены аналогичные результаты, что дополняет имеющуюся базу данных. Следует подчеркнуть, что гипоксия является бластогенным фактором c высоким злокачественным потенциалом. Белок-1, стимулируемый гипоксией (Hypoxia-inducible factor 1-alpha), является активатором ангиогенеза и одним из триггеров развития апоптоза эпителиоцитов СОП, при этом его экспрессия напрямую коррелирует с активностью тиоредоксина. В свою очередь, тиоредоксин (thioredoxin), относящийся к классу малых окислительно-восстановительных молекул, которые экспрессируются почти во всех тканях организма, имеет важное значение для жизнеспособности клетки, регулирует активность апоптоза через сигналрегулирующую киназу-1 и протеинкиназы. Прихибитин-2 (prohibitin-2) участвует в регуляции прогрессии клеточного цикла, может подавлять репликацию ДНК, снижать оксидативный стресс. Таким образом, в основе повреждающего действия щелочного рефлюктата лежат процессы тканевой и клеточной гипоксии, инициирующие апоптоз клеток СОП, и процессы пролиферации клеток базальной мембраны пищевода [14]. Если оценивать последствия обнаруженного нами изменения экспрессии белков при ГЭРБ, то они в подавляющем большинстве имеют отрицательный характер. Вне зависимости от характера рефлюктата у больных с ГЭРБ имеют место нарушения межклеточного взаимодействия, изменения пролиферативной активности слизистой оболочки и активация оксидативного стресса. Известно, что основным компонентом плотных межклеточных контактов, выполняющим важную роль в поддержании нормальной гистоархитектоники эпителиальных тканей, является E-кадгерин [16]. Первые работы, посвященные роли Е-кадгерина в прогрессировании ГЭРБ, были проведены в 1994 г. J.Jankowski и соавт. и показали, что экспрессия Е-кадгерина снижается в метапластических и диспластических клеточных линиях [17]. Однако в ряде последующих исследований получены неоднозначные результаты об изменении экспрессии Е-кадгерина при различных формах и градациях ГЭРБ [18, 19], что подчеркивает актуальность изучения этого биомаркера клеточной адгезивности. В ходе исследования было установлено, что экспрессия Е-кадгерина регистрировалась на мембране эпителиальных клеток. Для оценки степени выраженности нарушений межклеточных контактов экспрессия Е-кадгерина оценивалась в таких структурах, как: многослойный плоский эпителий, покровный железистый эпителий и зоны кишечной метаплазии. Полуколичественная оценка экспрессии Е-кадгерина 3 (+++) отражает состоятельность эпителиального барьера, 1 (+) - проявление выраженных нарушений гистоархитектоники. В 1-й группе у 7 (17,9%) больных была выявлена кишечная метаплазия СОП. При анализе мембранной экспрессии Е-кадгерина в многослойном плоском эпителии у 21 (65,6%) человека мембранная экспрессия Е-кадгерина была выражена умеренно (2++), 6 (15,3%) - резко выражена (3+++) и 5 (12,8%) - резко снижена (1+); рис. 1. В покровном железистом эпителии кардиального отдела пищевода в большинстве случаев (у 21 пациента, 65,6%) отмечена умеренная (2++) мембранная экспрессия Е-кадгерина, резко выраженная экспрессия (3+++) наблюдалась у 11 (33,7%) больных (рис. 2). В зонах кишечной метаплазии в 5 (71,6%) случаях отмечена умеренно выраженная (2++) мембранная экспрессия Е-кадгерина, у 1 (14,2%) больного - слабовыраженная (1+), 1 (14,2%) - резко (3+++); рис. 3. Таким образом, кислый рефлюкс не оказывает выраженного влияния на межклеточные контакты, что подтверждается умеренным уровнем экспрессии Е-кадгерина у большинства пациентов 1-й группы. У пациентов 2-й группы были зарегистрированы более существенные различия рассматриваемого показателя. В многослойном плоском эпителии у 12 больных выраженность экспрессии Е-кадгерина распределялась в равной степени между умеренной (2++; 43%) и резко выраженной (3+++; 43%), у 2 (14%) человек была резко снижена - 1+ (рис. 4). Экспрессия Е-кадгерина в железистом эпителии у больных, у которых он был представлен в биоптатах (8 человек, 60%), была резко снижена - 1+ (рис. 5). Кишечная метаплазия в СОП была констатирована в 11 (44%) случаях, при этом в измененном эпителии отмечено резкое снижение экспрессии Е-кадгерина: так, умеренная экспрессия (2++) выявлена у 3 (25%) пациентов, у 8 (75%) она носила характер мелких фокусов (1+); рис. 6. Выявленные изменения экспрессии Е-кадгерина свидетельствуют о большем повреждающем воздействии щелочного рефлюктата на СОП. Таким образом, у 46% пациентов обеих групп выявлено снижение мембранной экспрессии Е-кадгерина как в покровном железистом эпителии, так и в зонах кишечной метаплазии. Экспрессия Е-кадгерина у всех пациентов, имеющих кишечную метаплазию, снижалась от слабой (1+) до умеренной (2++). Отмечалось значительное снижение экспрессии Е-кадгерина (1+) в зонах кишечной метаплазии у пациентов с рефлюксом желчи относительно всех больных с кишечной метаплазией при кислом и/или слабокислом рефлюксе. Принимая во внимание состав щелочного рефлюктата, представленного желчными кислотами, трипсином, лизолецитином, и механизмы его повреждающего действия - повышение проницаемости клеточной мембраны, влияние на клеточную пролиферацию, апоптоз и дифференцировку, остаются открытыми вопросы расширения стандартного протокола лечения пациентов с ГЭРБ [20, 21]. Особенности протеомного профиля СОП и экспрессии Е-кадгеринов у пациентов с преимущественно щелочным характером рефлюктата позволяют предположить необходимость длительной цитопротективной терапии с использованием урсодезоксихолевой кислоты (УДХК) [22, 23]. Обоснованность данного предложения подтверждается целым рядом исследований. Так, J.Амaral и соавт. (2009 г.) были получены данные, достоверно показывающие, что применение препаратов УДХК позволяет ингибировать классические пути апоптоза и регулирует процессы окислительного стресса [23]. Клиническая эффективность дифференцированного подхода к терапии ГЭРБ с учетом характера рефлюктата была продемонстрирована в исследовании Н.Б.Лищук и соавт. «ВозможноСТи ОПтимизации диагностики и терапии различных вариантов ГастроЭзофагеальной Рефлюксной Болезни» (2017 г.). Оценивая 6-недельный курс терапии ГЭРБ Урсосаном и Итомедом, авторы формулируют вывод о том, что комбинированное назначение прокинетиков и препаратов УДХК у пациентов с преобладанием слабощелочных рефлюксов оказывает благоприятное влияние на клинико-эндоскопическую картину и моторику верхних отделов желудочно-кишечного тракта [22]. Таким образом, современные биоинформационные диагностические подходы обеспечивают возможность представления более детализированной оценки патогенетических изменений в СОП при ГЭРБ. Анализ характерных особенностей повреждения слизистой пищевода в зависимости от характера рефлюктата определяет и содержание патогенетической терапии. Полученные данные указывают на возможность расширения стандартного протокола лечения ГЭРБ путем включения препаратов УДХК.

About the authors

G. N Tarasova

Rostov State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: doctor-gastro@yandex.ru
344022, Russian Federation, Rostov-on-Don, per. Nakhichevanskii, d. 29

E. A Smirnova

Rostov State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

344022, Russian Federation, Rostov-on-Don, per. Nakhichevanskii, d. 29

References

Supplementary files