The diagnostic value of the study of the cytochemical activity of enzymes in hereditary mitochondrial diseases

Full Text

Митохондрии - клеточные органеллы, ответственные за энергетический обмен клеток. В митохондриях осуществляются 4 типа обмена: углеводный, жировой, в котором участвует карнитин, аминокислотный, а также перенос электронов в цикле дыхательной цепи (окислительное фосфорилирование). В этом процессе участвуют 5 комплексов энзимов, большинство из них кодируется хромосомной ДНК, но 13 - ДНК митохондрий. Центральная нервная система отличается высоким уровнем энергетического метаболизма, поэтому снижение внутриклеточной продукции аденозинтрифосфата и увеличение уровня глутамата сильнее по сравнению с другими органами и тканями сказывается на ее функционировании, что происходит при снижении эффективности окислительного фосфорилирования. Митохондриальные заболевания обусловлены генетическими дефектами, которые приводят к нарушениям тканевого дыхания. Митохондриальные болезни по типу наследования делят на 3 группы: 1) обусловленные мутациями митохондриальной ДНК (мДНК), передающиеся по наследству по митохондриальному типу; 2) обусловленные мутациями ядерной ДНК, наследуемые по аутосомно-рецессивному или аутосомно-доминантному типу; 3) обусловленные нарушением межгеномных сигнальных эффектов [1-3]. Наиболее частыми неврологическими митохондриальными болезнями являются синдром SANDO (sensory ataxia neuropathy, dysarthria, ophthalmoparesis - сенсорная атактическая невропатия, дизартрия и офтальмопарез), лейкоэнцефалопатия с преимущественным поражением ствола головного мозга, спинного мозга и повышенным лактатом, синдром MERRF (myoclonic epilepsy with ragged red fibers - миоклоническая эпилепсия с рваными красными мышечными волокнами), атрофия зрительных нервов Лебера. Синдром SANDO - аутосомно-рецессивное заболевание. Является вариантом хронической прогрессирующей наружной офтальмоплегии. Отмечаются также сенсорная атактическая невропатия и дизартрия. Выявляются мутации в гене POLG, кодирующем каталитическую субъединицу мДНК-полимеразы. Ген расположен на хромосоме 15q25 группы. Заболевание относится к группе митохондриальных болезней, обусловленных мутацией ядерной ДНК [4, 5]. Лейкоэнцефалопатия с преимущественным поражением ствола головного мозга, спинного мозга и повышенным лактатом (leukoencephalopathy with brainstem and spinal cord involvement and lactate elevation - LBSL) - митохондриальное наследственное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования. Ген болезни DARS2, который кодирует митохондриальную аспартил-тРНК-синтетазу, расположен на длинном плече хромосомы 1 (локус 1q25.1) [6]. Синдром MERRF относится к группе митохондриальных болезней, обусловленных мутацией в одном из ряда генов мДНК, что приводит к нарушениям белкового синтеза. Наследственная оптическая невропатия Лебера, или атрофия зрительных нервов Лебера (АЗНЛ), - наследственное заболевание, обусловленное мутацией в одном из генов (МТ-ND1, МТ-ND4, МТ-ND4L и MT-Nd6) мДНК, кодирующих белки, участвующие в окислительном фосфорилировании, Синдром PEOA3 (progressive external ophthalmoplegia with mitochondrial DNA deletions, autosomal dominant, 3 - прогрессирующая наружная офтальмоплегия с делециями мДНК, аутосомнодоминантная, тип 3) - это миопатия из группы истощения (деплеции) мДНК. Наиболее характерны прогрессирующие птоз и наружная офтальмоплегия, слабость в скелетных мышцах. Тип наследования - аутосомно-доминантный. Цель - изучить активность митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови цитохимическим методом. Материал и методы Обследованы 8 больных с наследственной неврологической митохондриальной патологией. Для оценки тканевого дыхания (дыхательной цепи митохондрий) и других видов обмена в митохондриях проводили цитохимический анализ лимфоцитов в периферической крови, при этом оценивали активность 4 ферментов митохондрий, участвующих в углеводном обмене (лактатдегидрогеназа - ЛДГ), обмене аминокислот (глутаматдегидрогеназа - ГДГ), обмене жирных кислот (a-глицерофосфатдегидрогеназа - a-ГФДГ), и II комплекса дыхательной цепи митохондрий (сукцинатдегидрогеназа - СДГ) [7]. Использовали химические реактивы: фиксатор для мазков периферической крови (ацетон-трилон), цитохимические наборы для определения активности дегидрогеназ (ООО НПП «Поликом»), краситель для докрашивания ядер (метиловый зеленый). Оборудование: бинокулярный микроскоп (увеличение не менее 10×40), оснащенный объективом с водной иммерсией, водяной термостат, обеспечивающий поддержание температуры с точностью до 0,1ºС, рН-метр. Приводим краткое описание метода количественного цитохимического определения активности ферментов в клетках периферической крови. Реакции проводили на мазках крови, приготовленных на обезжиренных предметных стеклах. Мазки высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Постановка реакции включала 3 этапа: фиксацию мазков, реакцию для выявления активности ферментов, докраску ядер. Фиксация препаратов проводилась в 60% растворе ацетона, насыщенном трилоном Б, при pH 5,2-5,4 при комнатной температуре в течение 30-40 с (для лимфоцитов). После фиксации препараты промывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре на воздухе. Состав инкубационной среды: на 40 мл фосфатного буфера 13 мг п-нитротетразолия фиолетового, 13 мг трилона Б, специфический субстрат для определенного фермента. Реакция проводилась при рH 7,3 и температуре 37ºС в течение 60 мин в водном термостате. После инкубации мазки промывали водой и погружали в насыщенный раствор метилового зеленого (ядерного красителя) на 15-20 с, после чего мазки вновь промывали и высушивали при комнатной температуре на воздухе. Готовые мазки микроскопировали под водной иммерсией на микроскопе Микмед-6. Об активности фермента в клетке судили по количеству темно-фиолетовых гранул формазана, образовавшихся в процессе восстановления п-нитротетразолия фиолетового. Для определения активности фермента в популяции лимфоцитов подсчитывали количество гранул в 30-100 клетках. Ферментативная активность при использовании этого метода выражалась в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул продукта цитохимической реакции - формазана. Также определяли уровень лактата в крови до и после нагрузки углеводами. Для выявления нарушений обмена веществ в митохондриях проведено обследование 8 пациентов с наследственной митохондриальной патологией (АЗНЛ - 3, синдром SANDO - 1, синдром MERRF - 1, синдром PEOA3 - 1, синдром MELAS - 1, синдром POLG1 - 1). Всем пациентам диагноз митохондриального заболевания был подтвержден в лаборатории ДНК-диагностики и биохимической лаборатории ФГБНУ «Медико-генетический научный центр». Результаты Демографические показатели обследованных пациентов представлены в табл. 1. У всех 3 пациентов с АЗНЛ в неврологическом статусе были выявлены нарушения остроты зрения со снижением до 0,05-0,01, концентрическое сужение полей зрения, других очаговых симптомов не отмечалось. При МРТ-обследовании у 1 пациента патологии выявлено не было, у 2 - единичные перивентрикулярные гиперинтенсивные очаги в режиме Т2, не накапливающие контраст. У пациентки с синдромом SANDO обнаружены когнитивные нарушения в виде отставания умственного развития, снижения памяти, сходящееся косоглазие, тремор, нарушения при выполнении координаторных проб, атаксия при ходьбе. При МРТ-исследовании - множественные гиперинтенсивные на Т2-изображениях перивентрикулярные овальные очаги диаметром 0,5-1,0 см в белом веществе обоих полушарий головного мозга, незначительное расширение ликворных пространств ствола мозга. При синдроме MERRF у больной наряду с эпилепсией отмечались выраженные когнитивные нарушения. Заболевание началось в 19 лет с мышечных подергиваний. Через 2 года появились генерализованные судорожные припадки. Проведена молекулярная диагностика, выявлена гетероплазмия по мутации МТ r-RNA-lys A8344G, у пробанда в 50%, у матери пробанда - в 40%. Обнаружена частая мутация A8344G в регионе, кодирующем транспортную РНК лизина. Больная принимает противосудорожную терапию. На магнитно-резонансной томограмме (МРТ) головного мозга - без патологических изменений. На электроэнцефалограмме выявлялись эпилептиформные изменения при гипервентиляции и фотостимуляции. У матери, ее 3 сестер, брата, дочери одной из сестер, бабушки и прабабушки по линии матери - такое же заболевание. В неврологическом статусе - мелкоразмашистые миоклонии в конечностях, снижена вибрационная чувствительность в пальцах стоп. В позе Ромберга при закрывании глаз падает. Пальценосовую и пяточно-коленную пробы выполняет с интенцией. Когнитивные функции по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE) - 21 балл. Больная митохондриальной миопатией [синдром PEOA3 из группы истощения (деплеции) мДНК] жаловалась на опускание век, двоение в глазах. Больна с 38 лет. У брата, сестры, отца, сына брата - такое же заболевание. В неврологическом статусе - птоз век, снижение ахилловых рефлексов, неустойчивость в позе Ромберга при отсутствии зрительного контроля, снижение вибрационной чувствительности в пальцах стоп. Когнитивные функции по шкале MMSE - 26 баллов. Нет повышения креатинфосфокиназы в крови. Лактат в крови до еды 1,2, после еды - 1,3 ммоль/л. При электромиографии круговой мышцы глаза декремента М-ответа не выявлено. При игольчатой электромиографии выявлены признаки первично-мышечного поражения. В12 и фолиевая кислота в крови в пределах нормальных значений. При проведении ДНК-диагностики обнаружена мутация Ala359Thr в гетерозиготном состоянии в гене TWINKL, ответственном за возникновение синдрома PEOA3 OMIM 609286. Заболевание наследуется по аутосомно-доминантному типу. Относится к синдрому истощения (деплеции) мДНК. Синдром представлен гетерогенной группой заболеваний, обусловленной мутацией в 10 различных генах. У больной 19 лет с синдромом MELAS были речевые нарушения. С 8 лет отмечались инсультоподобные эпизоды. С 19 лет появились эпилептические приступы. При осмотре отмечались моторная афазия, аграфия, алексия, акалькулия, правосторонний гемипарез, миопатический синдром. У 1 больной диагностирована митохондриальная энцефалопатия, обусловленная мутацией в гене POLG1. Клиническая картина характеризовалась эпилептическими приступами, двусторонним полуптозом, сходящимся косоглазием, асимметрией носогубных складок, горизонтальным нистагмом, девиацией языка, наличием патологических кистевых рефлексов, диффузной мышечной гипотонией, оживлением сухожильных рефлексов и наличием патологического рефлекса Бабинского. Отмечались также хореоатетоидный гиперкинез, гиперкинезы языка. На МРТ головного мозга выявлены симметричные очаги демиелинизации в области ствола, очаги лейкопатии перивентрикулярно в области задних рогов. Результаты исследования активности митохондриальных ферментов (СДГ, a-ГФДГ, ГДГ, ЛДГ) в лимфоцитах периферической крови представлены в табл. 2. Как представлено в табл. 2, при обследовании 3 больных с АЗНЛ у 2 уровень активности СДГ был повышен и у 1 - снижен. Активность a-ГФДГ была снижена у всех больных. Активность ГДГ оказалась сниженной у 2, у 1 - в пределах нормальных значений. Показатели ЛДГ были в пределах референсных значений. Уровень лактата в крови обследованных пациентов составил 2,3-2,9 ммоль/л до еды и 2,5-2,7 ммоль/л - после нагрузки углеводами при нормальном значении показателя 1,6 ммоль/л. У пациентки с синдромом SANDO отмечены повышение уровня СДГ, снижение показателей активности a-ГФДГ и ГДГ, в то время как активность ЛДГ изменена не была. Лактат в крови до еды составил 2,2 ммоль/л, после еды - 3,1 ммоль/л. При синдроме MERRF у пациентки цитохимические показатели активности митохондриальных ферментов были тотально снижены. Лактат до еды составил 2,6 ммоль/л, после еды - 3,9 ммоль/л. Следует отметить, что пациентка принимала противосудорожную терапию, которая была жизненно необходима, хотя эти препараты, как известно, снижают функцию митохондрий. У пациентки с митохондриальной миопатией (синдром PEOA3) показатель СДГ был снижен незначительно, уровень a-ГФДГ - умеренно, уровень ГДГ - существенно, в то время как показатель ЛДГ оказался повышенным. При этом уровень лактата в крови до еды был повышен до 2,1 ммоль/л. После еды он снижался до нормальных значений. При синдроме MELAS лактат в крови натощак и после еды варьировал от 1,4 и 1,8 ммоль/л до 2,2 и 3,1 ммоль/л соответственно. При цитохимическом исследовании активности митохондриальных ферментов уровень СДГ, a-ГФДГ и ГДГ был снижен, а ЛДГ - в пределах нормальных значений. У 1 пациентки с митохондриальной энцефалопатией, обусловленной мутацией в гене POLG1 (синдром Альперса-Гуттенлохера), цитохимические показатели активности митохондриальных ферментов были изменены: наиболее значительно был снижен показатель ГДГ (более чем в 2 раза по сравнению с нижней границей нормального значения), также был снижен уровень a-ГФДГ. Показатели СДГ и ЛДГ были в пределах нормальных значений. Лактат до еды в крови составил 1,4 ммоль/л, после еды он повысился до 2,6 ммоль/л. Заключение Диагностика митохондриальных заболеваний с неврологическими проявлениями сложна, поскольку клинические признаки вариабельны, а дополнительные исследования зачастую не дают дополнительной информации. Определенных биомаркеров митохондриальных болезней для практического применения нет. Исследование уровня креатинфосфокиназы в плазме крови у таких пациентов для подтверждения повреждения мышц малоинформативно, обнаруживается нормальный или умеренно повышенный до 5 раз относительно верхней границы нормы [8, 9]. Лактатацидоз является одним из кардинальных признаков дефекта тканевого дыхания, поэтому определение уровня лактата в плазме крови может быть показательным. Есть предположения о взаимосвязи между высоким уровнем лактата и риском смерти пациентов [10, 11]. P.Chinnery [12] отмечает, что уровень лактата выше 3 ммоль/л в крови или выше 1,5 ммоль/л в спинномозговой жидкости натощак подтверждает диагноз митохондриального заболевания, однако меньшие показатели не отвергают этот диагноз. «Золотым стандартом» диагностики считают морфологическое исследование. Е.А.Николаева и соавт. [13] отметили, что основными морфологическими, энзиматическими и функциональными критериями служат: 1) «рваные» (шероховатые) красные волокна (RRF) в мышечной ткани в количестве более 2%; 2) наличие цитохромоксидаза-негативных волокон; 3) снижение активности комплексов дыхательной цепи ниже 20-30% от нормы. При этом авторы подчеркивают отсутствие данных показателей у ряда больных с митохондриальными болезнями. Ранее В.С.Сухоруков и соавт. [7, 14] продемонстрировали корреляции между результатами гистологических и цитохимических исследований у пациентов с митохондриальными заболеваниями. В проведенном исследовании определяли метаболические нарушения при митохондриальной неврологической патологии. Показатель уровня лактата в крови был повышен у всех обследованных пациентов, при этом не было отмечено закономерности в увеличении лактата после нагрузки углеводами: в одних случаях показатель увеличивался, в других - уменьшался. Наиболее значительно после нагрузки углеводами уровень лактата в крови увеличился при синдроме MERRF. Показатели активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови также были наиболее изменены при синдроме MERRF, причем уровень всех исследованных ферментов был снижен. На 2-м месте по выраженности изменений активности митохондриальных ферментов оказался синдром SANDO, при котором выявлены компенсаторное повышение активности фермента дыхательной цепи митохондрий СДГ и снижение ферментов, участвующих в жировом обмене и обмене аминокислот. Менее выраженные изменения активности митохондриальных ферментов оказались при атрофии зрительных нервов Лебера, было отмечено как компенсаторное повышение активности СДГ, так и снижение активности ферментов, участвующих в жировом и аминокислотном обмене. Таким образом, при наследственных митохондриальных заболеваниях с неврологическими нарушениями исследование показателей активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови в сочетании с исследованием уровня лактата натощак и после нагрузки глюкозой оказалось информативным и позволяет выявить степень функциональных нарушений, определить необходимость и направление коррекции метаболических нарушений.

About the authors

I. A Kazantseva

M.F.Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

129110, Russian Federation, Moscow, ul. Shchepkina, d. 61/2

S. V Kotov

M.F.Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

Email: kotovSV@yandex.ru
129110, Russian Federation, Moscow, ul. Shchepkina, d. 61/2

E. V Borodataya

M.F.Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

Email: Elena.borodataya@gmail.com
129110, Russian Federation, Moscow, ul. Shchepkina, d. 61/2

O. P Sidorova

M.F.Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

Email: sidorovaop2008@rambler.ru
129110, Russian Federation, Moscow, ul. Shchepkina, d. 61/2

A. S Kotov

M.F.Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institute

Email: alex-013@yandex.ru
129110, Russian Federation, Moscow, ul. Shchepkina, d. 61/2

References

Supplementary files