Correlation of antiviral antibodies and morphological changes in bladder cancer patients

Full Text

Введение В настоящее время существует множество прогностических критериев рака мочевого пузыря (РМП), однако универсального критерия разработать так и не удалось. Темпы прироста заболеваемости РМП все возрастают [1]. Этиологическая роль убиквитарных вирусных инфекций в генезе РМП является неясной, а данные литературы весьма противоречивы. Количество вирус-ассоциированных опухолей растет [2]. Проводятся исследования, направленные как на изучение онкогенности вирусов, так и на развитие онколитического эффекта некоторых герпес-вирусов и аденовирусов, создаются вирусные векторы, в том числе и для лечения РМП [3]. Появились препараты, воздействующие на лимфоцитарное звено путем повышения иммунного статуса организма [4]. Существование стволовых клеток, обладающих высоким потенциалом деления и дифференцировки, было показано для различных клеточных популяций организма человека. Работы последних 15 лет подтверждают наличие для многих типов опухолей субпопуляции стволовых клеток опухоли, способных дать начало всем субклонам опухолевых клеток [5]. Аналогично тканевым стволовым клеткам стволовые клетки опухоли крайне чувствительны к сигналам микроокружения и стромальным взаимодействиям. Особо важную роль играют сигналы интегриновых взаимодействий с межклеточным матриксом, а также сигнальные пути, которые в норме активируются только в процессе эмбрионального развития (Notch, Wnt, Hedgehog, Bone morphogenetic proteins/Transforming growth factor b1 - TGF-b1) [5]. Важным свойством стволовых клеток опухоли признана способность к асимметричному делению, в результате которого возникает одна клетка со стволовыми свойствами исходной клетки и одна клетка, утрачивающая способность делиться асимметрично, но обладающая неконтролируемым пролиферативным потенциалом и высокой инвазивностью. Таким образом, с одной стороны, сегодня считается общепризнанным, что различие между поверхностным и инвазивным РМП осуществляется при проявлении одного из двух событий - мутаций FGFR3 или инактивации пути p53/Rb/PTEN. С другой стороны, пока не найдено достоверных свидетельств, определяющих, происходят ли эти события в одной клетке, предположительно базальной, или осуществляются в разных клетках-предшественниках уротелия [6]. В одной из последних работ, посвященных влиянию цитомегаловируса (ЦМВ) на диспластические процессы внутреннего уха, авторами в эксперименте был детально рассмотрен патогенез их развития. Доказано, что ЦМВ индуцирует значительные изменения в клеточно-специфической дифференцировке FGFR3- и Notch-белков по сравнению с контрольной группой [7]. ЦМВ стимулирует продукцию клеточных иммуносупрессивных цитокинов TGF-b1 в различных опухолевых клетках, включая клетки глиобластомы, остеосаркомы, клетки крови [8, 9]. В литературе все больше появляется исследований, посвященных механизмам онкогенности вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) при раке желудка и назофарингеальной карциноме. X.Wan и соавт. доказали, что ВЭБ-микроРНК, такие как BART3 и BART5, повреждают гены в p53, TGF-b и Wnt сигнальных путях, тем самым влияя на апоптоз и трансформацию клеток назофарингеальной карциномы [10]. M.Guelley и соавт. подчеркивают, что «ВЭБ является не просто сторонним наблюдателем развития аденокарциномы желудка, но тесно связан с патогенезом развития и поддержания опухолевого процесса». Авторы указывают на особенности метилирования у ВЭБ-положительных опухолевых клеток, связанных с угнетением CDKN2A (p16), но не MLH1. ВЭБ-положительный рак часто имеет мутированный PIK3CA и ARID1A и амплифицированный 9p24.1-локус, связанный с гиперэкспрессией JAK2, CD274 (PD-L1) и PDCD1LG2 (PD-L2). Усиленно экспрессируются многочисленные некодирующие вирусные ДНК. Пациентам, у которых была неэффективна стандартная терапия, исследователи предлагают участие в протоколах с использованием терапии, направленной на разрушение опухоль-ассоциированных генных путей человека либо деструкцию инфицированных клеток через индукцию литических ВЭБ-генов [11]. Q.Liang и соавт. выявили около пяти сигнальных путей, на которые влияют только ВЭБ-ассоциированные геномные и эпигеномные альтерации. Мутации в генах AKT2, CCNA1, MAP3K4 и TGFBR1 чаще выявлялись в ВЭБ-положительных раковых клетках. Кроме того, исследователи указывают на то, что ВЭБ-ассоциированная мутация, в частности в гене AKT2, была связана со снижением периода выживания у пациентов с ВЭБ-положительным раком желудка (p=0,006) [12]. Материалы и методы Проведено обследование и лечение100 больных (72 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 38 до 90 лет (средний возраст 65±10), поступивших в стационар с направительным диагнозом РМП. Дополнительно к общепринятым методам обследования при РМП выполнен иммуноферментный анализ крови на наличие иммуноглобулинов (Ig)G, M к вирусу простого герпеса (ВПГ) 1 и 2-го типов, ЦМВ, ВЭБ. Ткань опухоли и моча взяты на ПЦР-диагностику наличия ВПГ 1 и 2-го типов, вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска, ЦМВ, ВЭБ. Была произведена оценка воспалительной инфильтрации в опухолевой ткани и подлежащей строме у 71 из 100 больных. Полуколичественно от 0 до 3 баллов (отсутствие, слабая, умеренная и выраженная степень) оценивались следующие признаки. Лимфоцитарно-плазмоцитарный инфильтрат: а) в опухоли; б) рассеянный в подлежащей строме; в) периваскулярная инфильтрация; г) очаговая гиперплазия лимфоидной ткани в виде лимфоидных фолликулов. Активность воспаления: а) степень лейкоцитарного инфильтрата; б) степень эозинофильной инфильтрации. Цитопатические изменения: а) внутриклеточные включения (койлоцитоз); б) внутриядерные включения. Применялся ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) для выявления показателей уровня противовирусных антител в качестве прогностического фактора. Для этого вычисляли параметр - площадь под кривой (AUC) для определения качества модели. Качество модели в зависимости от AUC: • 0,9-1,0 - отличное; • 0,8-0,9 - очень хорошее; • 0,7-0,8 - хорошее; • 0,6-0,7 - среднее; • до 0,6 - неудовлетворительное. Результаты У пациентов с рецидивным характером опухоли имело место повышение уровня анти-ЦМВ IgG (616,5±501,46 vs 339,06±306,61; p=0,0017) и анти-ВЭБ IgG-EBNA (254,99±222,23 vs 143,54±169,89; p=0,0118). Для прогноза рецидива опухолевого роста на основании показателя анти-ЦМВ IgG получена модель очень хорошего качества, выявлена точка cut-off = 670 ед/мл, т.е. прогностическое значение показателя, разделяющее больных с рецидивным характером опухоли от первичного поражения мочевого пузыря (рис. 1). Для больных со стадией процесса T1 точка разбиения также составила 670 ед/мл. Относительный риск (ОР)=2,96, 95% доверительный интервал (ДИ) 1,41-6,23. Подобная модель хорошего качества получена и для уровня анти-ВЭБ Ig-EBNА, точка cut-off составила 157 ед/мл (рис. 2). Если рассматривать прогностические показатели полифокального поражения мочевого пузыря у пациентов с немышечно-инвазивным РМП на основании уровня противовирусных антител, то для показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA была получена модель среднего качества. Выявлена точка cut-off = 350 ед/мл, т.е. прогностическое значение показателя, разделяющее больных с единичной опухолью и полифокальным поражением мочевого пузыря (рис. 3). Для показателя уровня анти-ЦМВ IgG у этой категории больных была также получена модель хорошего качества, точка cut-off составила 60,8 ед/мл (рис. 4). Учитывая наличие коррелятивных связей между морфологическими изменениями (рис. 5, 6), в частности лимфоидно-плазмоцитарного звена, цитопатическими изменениями и стадией процесса, а также степенью анаплазии, мы попытались найти точки разбиения уровня противовирусных антител и морфологических изменений как показателя неблагоприятного течения опухолевого процесса. Суммируя сводные данные рис. 5, можно сказать, что, чем более выражены цитопатические изменения (наличие внутриядерных включений) и изменения лимфоцитарно-плазмоцитарного звена, тем выше стадия процесса. Что касается степени анаплазии (см. рис. 6), то здесь прослеживается та же тенденция: чем выше степень анаплазии, тем более выражены изменения лимфоцитарно-плазмоцитарного звена. Наличие папилломатоза свидетельствует, наоборот, о более благоприятном течении опухолевого процесса. Кроме того, нами получены коррелятивные связи между уровнем противовирусных антител, наличием вирусов в опухоли и морфологическими изменениями. В связи с этим мы попытались найти определенный уровень антител, при котором возникают те или иные морфологические изменения. Это, в свою очередь, позволит спрогнозировать течение опухолевого процесса, тем более что иммуноферментное исследование противовирусных антител может быть выполнено в любой лаборатории. Для прогнозирования наличия лимфоцитов в опухоли (рис. 7) и периваскулярной лимфоидной инфильтрации (рис. 8) на основании показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA получена модель хорошего качества, выявлена точка cut-off = 61,2 ед/мл для обоих показателей. Следует отметить, что специфичность данных для показателя наличия лимфоцитов в опухоли крайне низка. Таким образом, повышение уровня анти-ВЭБ IgG-EBNА>61,2 ед/мл свидетельствует о появлении у пациентов, страдающих РМП, как периваскулярной инфильтрации, так и лимфоцитов в опухоли. Койлоцитоз как проявление ВПЧ-инфекции был зафиксирован у 44 (62,0%) из 71 пациента. Были выявлены умеренные коррелятивные связи между наличием койлоцитоза и уровнем анти-ВПГ IgG (R=0,266, p=0,026). Для прогноза наличия койлоцитоза на основании показателя уровня анти-ВПГ IgG получена модель хорошего качества, выявлена точка cut-off = 17,2 ед/мл (рис. 9). Вполне возможно, что именно ВПГ выступают в качестве кофактора ВПЧ-инфекции. Деструктивные изменения в опухоли относятся к вторичным изменениям при атипичном росте. Учитывая высокую химическую агрессивность окружающей среды при опухолях мочевого пузыря, деструктивно-некротические процессы имеют важное прогностическое значение. Данный фактор в сочетании с различной степенью инвазии влияет как на особенности хирургического вмешательства, так и на скорость развития метастатического роста. Эрозирование и изъязвление как опухолевой поверхности, так и окружающих тканей мочевого пузыря сопровождается наряду с воспалительными изменениями выраженным полнокровием и очаговым ангиоматозом, что в данном случае является еще более провокационным в плане ускорения метастатического роста [13]. Наличие деструктивных изменений клеток коррелирует со стадией заболевания, поэтому на основании показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA для прогноза наличия деструкции поверхности опухолевых клеток была получена модель очень хорошего качества, выявлена точка cut-off = 180 ед/мл. Таким образом, можно предполагать прогрессию опухолевого роста при повышении уровня анти-ВЭБ IgG-EBNA>180 ед/мл (рис. 10). Наличие папилломатоза как такового свидетельствует о начальной стадии опухолевого роста и более благоприятном течении опухолевого процесса, что не противоречит данным литературы [14, 15]. Согласно теории опухолевого роста поля канцеризации - феномен, свойственный, скорее всего, только эпителиальным опухолям, обусловленный защитной барьерной функцией эпителиальных клеток. Осуществление защитной функции предполагает воздействие на пласт эпителиальных клеток экологически вредных, в том числе канцерогенных веществ. В результате образуются протяженные районы, содержащие клетки с генетически измененным наследственным аппаратом. Способность эпителиальных клеток к самообновлению приводит к аномальной пролиферации, возникновению гиперпластических, а затем и диспластических процессов. Эти процессы в сочетании с генетическими повреждениями приводят к трансформации клеток и появлению злокачественного клона [6]. По нашим данным, паппиломатоз не был ассоциирован с высокой стадией процесса, степенью анаплазии, а также не выявлено ассоциации папилломатоза с иммунологическими и морфологическими признаками герпес-вирусных инфекций (ЦМВ и ВЭБ). На основании показателя анти-ЦМВ IgG с целью прогнозирования наличия папилломатоза нами получена модель хорошего качества, выявлена точка cut-off = 1212 ед/мл (рис. 11). Если рассматривать прогностические точки (точки разбиения) уровня противовирусных антител у больных немышечно-инвазивным РМП, то, несмотря на то что не все данные были статистически достоверными, мы получили модели хорошего и отличного качества с высоким ДИ. Отсутствие статистической достоверности в данном случае связано с небольшим числом больных. Сводные данные представлены в таблице. Для каплевидного, щупальцеобразного (рис. 12) вида инвазии характерны обратные коррелятивные связи со степенью дифференцировки опухоли (R=-0,215, p=0,051), прямые - с наличием папилломатоза (R=0,310, p=0,006). С целью прогнозирования наличия каплевидного типа инвазии опухолевого роста на основании уровня анти-ВПГ 1 и 2-го типов IgG мы получили модель хорошего качества. Выявлена точка cut-off = 19,5 ед/мл (рис. 13). С целью оценки каплевидного типа инвазии на основании показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA получена модель хорошего качества, выявлена точка cut-off = 157 ед/мл (рис. 14). Коррелятивные связи смешанного вида инвазии представлены на рис. 15. Как видно из рис. 15, смешанный тип инвазии (рис. 16) также характеризуется усилением лимфоидно-плазмоцитарной инфильтрации и цитопатических изменений, а также отсутствием папилломатоза. Заключение По всей видимости, ВЭБ и ЦМВ воздействуют на TGF-b, Wnt, Notch, p53, FGFR3, возможно, и в стволовых клетках мочевого пузыря, изменяя их дифференцировку и снижая выживаемость пациентов. В таком случае становится понятна точка зрения M.Gulley [11], который предлагает использование терапии, направленной на разрушение опухоль-ассоциированных генных путей человека либо деструкцию инфицированных клеток через индукцию литических ВЭБ-генов. Учитывая гиперэкспрессию PD-L1 и PD-L2ВЭБ-инфицированными опухолевыми клетками, пациентам, возможно, показано назначение препаратов анти-PD-L1, которые находятся в стадии разработки. Однако есть первые результаты, которые свидетельствуют об эффективности лечения РМП у 43% больных (PD-L1-положительных) [16]. По нашим данным, напряженность лимфоцитарно-плазмоцитарного звена и цитопатических изменений как в опухолевой ткани, так и в строме является фактором неблагоприятного прогноза течения РМП и, по всей видимости, наличия у этой категории больных вирус-ассоциированнного опухолевого процесса. Такого же мнения придерживаются M.Fukayama и соавт. в отношении ВЭБ-положительного рака желудка [17]. Данные изменения коррелируют со стадией процесса, степенью анаплазии и уровнем противовирусных антител, наличием вирусов в опухолевой ткани, рецидивным характером опухоли. Нами установлены те уровни противогерпетических антител, при которых только появляются эти морфологические изменения. Возрастание уровня противовирусных антител и наличие указанных морфологических изменений могут служить факторами неблагоприятного прогноза опухолевого роста, а также указывать на необходимость проведения противовирусной терапии в послеоперационном периоде, поскольку она будет в данном случае являться этиологически и патогенетически оправданной. На наш взгляд, необходимо проводить исследование уровня противогерпетических антител острой фазы и ПЦР-диагностику наличия вирусных инфекций у пациентов молодого возраста, страдающих РМП, с последующим проведением противовирусной терапии согласно протоколам лечения острых герпес-вирусных инфекций (ВПГ 1 и 2-го типов, ВЭБ, ЦМВ). Это позволит снизить количество рецидивов и перехода опухоли в инвазивный процесс. Кроме того, пациентам с изначально высокими уровнями противовирусных антител, наличием морфологических признаков вирусного поражения мочевого пузыря, при агрессивном характере опухолевого роста целесообразно выполнять иммуногистохимическое исследование на наличие экспрессии PD-L1 с последующей терапией иммунопрепаратами анти-PD-L1, а также проведение противовирусной терапии по показаниям. Это позволит увеличить выживаемость данной категории больных. В послеоперационном периоде пациентам необходимо наблюдение как онколога, так и вирусолога. Выводы • Выявленные точки cut-off = 670 ед/мл для анти-ЦМВ IgG и 157 ед/мл - для анти-ВЭБ Ig-EBNА (р<0,05) позволят спрогнозировать с высокой степенью вероятности возможность рецидивирования опухоли мочевого пузыря. • Множественность поражения мочевого пузыря у больных немышечно-инвазивным уротелиальным раком можно предполагать при уровне анти-ВЭБ IgG-EBNA>350 ед/мл (р<0,05), для анти-ЦМВ IgG - при более 60,8 ед/мл (р<0,05). • При уровне анти-ВЭБ IgG-EBNA>61,2 ед/мл (р<0,05) можно спрогнозировать наличие лимфоцитов в опухоли и периваскулярной лимфоидной инфильтрации. • При уровне анти-ВПГ IgG>17,2 ед/мл (р<0,05) определяется наличие койлоцитоза. • Деструктивные изменения опухолевой клетки имеют место при уровне показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA>180 ед/мл (р<0,05). • Папилломатоз определяется при уровне анти-ЦМВ IgG>1212 ед/мл (р<0,05). • Для прогноза степени наличия каплевидного типа инвазии опухолевого роста выявлена точка cut-off для анти-ВПГ 1 и 2-го типов IgG>19,5 ед/мл (р<0,05), для анти-ВЭБ IgG-EBNA>157 ед/мл (р<0,05).

About the authors

I. V Kosova

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: kosovainga@mail.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

O. B Loran

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: oleg_loran@gmail.com
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

L. A Sinyakova

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: l.a.sinyakova@mail.ru
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

L. V Gundorova

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: ludovik-213@mail.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

V. A Kosov

Komi Republican Oncology Dispensary

Email: zinaidakosova@yandex.ru
167904, Russian Federation, Syktyvkar, Niuvchimskoe sh., d. 46

I. E Pogodina

Vologda Regional Clinical Hospital №2

Email: utk-irina@yandex.ru
162602, Russian Federation, Cherepovets, ul. Danilova, d. 15

D. N Kolbasov

City Clinical Hospital №68 of the Department of Health of Moscow

Email: urology68@rambler.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

References

Supplementary files