Comorbid viral infection in patients with bladder cancer

Full Text

Введение В основополагающей монографии, посвященной вирусному онкогенезу, «Infections causing human cancer» H. zur Hausen говорит о том, что около 20% всех видов рака ассоциировано с тем или иным инфекционным агентом [1]. В настоящее время доказана роль вируса папилломы человека (ВПЧ) при плоскоклеточном раке шейки матки и верхних дыхательных путей, раке молочной железы, особенно у пациенток молодого возраста [2-5]. Некоторые авторы указывают на наличие у этой группы пациентов активной сексуальной жизни, заболеваний, передающихся половым путем, орогенитальных контактов [5]. Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) является представителем онкогенных ДНК-содержащих вирусов. Диапазон онкологических заболеваний, ассоциированных с ним, постоянно растет. Доказано участие ВЭБ в развитии лимфомы Беркитта, назофарингеальной карциномы, волосатой лейкоплакии, рака желудка, рака молочной железы [6-10]. Онкомодулирующий эффект цитомегаловируса (ЦМВ) доказан при глиобластоме головного мозга [11]. Что касается вирусного канцерогенеза при раке мочевого пузыря, то в литературе крайне мало публикаций, посвященных этому вопросу [12-18]. При этом данные исследований противоречивы. В настоящее время активно обсуждается роль сочетанной вирусной инфекции в генезе различных онкологических заболеваний, таких как рак молочной железы, шейки матки, орофарингеальной локализации опухолевого процесса [19-24]. Указывается на способность одних вирусов потенцировать действие других, что увеличивает инвазивные свойства опухоли [20-24]. Материалы и методы В пилотном исследовании проведены обследование и лечение 100 больных (72 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 38 до 90 лет (средний возраст 65±10), поступивших в стационар с направительным диагнозом «рак мочевого пузыря». Дополнительно к общепринятым методам обследования при раке мочевого пузыря взяты анализы крови на иммуноглобулин (Ig) G, M к герпесу (вирусу простого герпеса - ВПГ) 1 и 2-го типа, ЦМВ, ВЭБ. Ткань опухоли и моча взяты на полимеразную цепную реакцию (ПЦР) - диагностику наличия вирусов ВПГ 1 и 2-го типа, ВПЧ высокого онкогенного риска, ЦМВ, ВЭБ. Была произведена оценка воспалительной инфильтрации в опухолевой ткани и подлежащей строме у 70 из 100 больных. Полуколичественно - от 0 до 3 баллов (отсутствие, слабая, умеренная и выраженная степень) оценивались следующие признаки: 1. Лимфоцитарно-плазмоцитарный инфильтрат: а) в опухоли; б) рассеянный в подлежащей строме; в) периваскулярная инфильтрация; г) очаговая гиперплазия лимфоидной ткани в виде лимфоидных фолликулов. 2. Активность воспаления: а) степень лейкоцитарного инфильтрата (количество полиморфно-ядерных лейкоцитов в 1 поле зрения микроскопа; ув. 40); б) степень эозинофильной инфильтрации. 3. Цитопатические изменения: а) внутриклеточные включения (койлоцитоз); б) внутриядерные включения. Мы провели исследование оценки маркеров пролиферации, ангиогенеза, апоптоза, ростовых факторов и маркеров адгезии у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани мочевого пузыря. Материалом для иммуногистохимического исследования послужил биопсийный и операционный материал от 32 пациентов с верифицированной опухолью мочевого пузыря. Из них у 21 больного выявлено наличие вирусных ДНК в опухолевой ткани, в 11 случаях вирусных ДНК выявлено не было. Операционный материал фиксировался в 1% растворе нейтрального формалина и заливался в парафин. Срезы толщиной 5 мкм, окрашенные гематоксилин-эозином, были подвергнуты обзорному морфологическому анализу, при котором стадию рака определяли в соответствии с классификацией TNM, а степень дифференцировки опухолевых клеток оценивали в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения от 1973 г. Микроскопическое изучение препаратов проводилось с применением бинокулярного микроскопа с фотоприставкой Axio Zeis при 400-кратном увеличении. Иммуногистохимическое исследование проводилось на серийных парафиновых срезах 95 мкм, использовался стрептавидин-биотиновый метод. В качестве детекционной системы использовалось 6 маркеров. Определялись следующие показатели: • маркеры пролиферативной активности Ki67, p63; • маркеры супрессора опухолевого роста Bcl-2, p53; • маркер ангиогенеза CD31; • маркер адгезии CD44; • ростовый фактор EGFR. Интенсивность реакций с антигенами, локализованными на мембранах клеток и внутриклеточных мембранах (CD44, CD31, EFGR и Bcl-2), оценивалась полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3, учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 - отсутствие реакции; 1 - слабая реакция; 2 - умеренная реакция; 3 - сильная реакция. Результаты реакции с антигенами, имеющими ядерную локализацию (Кi67, р63), оценивались по системе подсчета histochemical score, включающей в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю (%) окрашенных клеток и представляющей сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски: 0 - нет окрашивания; 1 - слабое окрашивание; 2 - умеренное окрашивание; 3 - сильное окрашивание. В работе использовались общепринятые методы статистической обработки данных: все числовые показатели проверялись на соответствие нормальному закону распределения с помощью критерия Лиллиефорса, определялись средние значения (M), стандартное отклонение (SD), ошибка среднего (m), 95% доверительный интервал (ДИ), частоты (%). Различия между количественными показателями осуществлялись с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок или непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия между частотой признаков находились с помощью критерия χ2-квадрат, точного критерия Фишера для малых выборок, для случаев частоты, равной 0 или 100%, использовался t-критерий Стьюдента для частот с поправкой на концевые точки. Для определения связи между изучаемыми параметрами применяли корреляционный анализ Пирсона (r) или Спирмена (R). Статистически значимыми принимались различия при p<0,05. Результаты Стадия процесса соответствовала T1NxM0 у 51 больного, в одном случае имела место папиллома мочевого пузыря, T2NxM0 - у 25 больных, в 23% случаев выявлен местно-распространенный процесс. У 7 пациентов имело место лимфогенное метастазирование. Трансуретральная резекция стенки мочевого пузыря с опухолью выполнена 70 больным, 16 больным - радикальная цистэктомия с формированием гетеротопического резервуара (уретерокутанеостомией в двух случаях и ряде случаев с сигмостомией), 14 пациентам - резекция мочевого пузыря. Опухоль была рецидивная у 24 пациентов. Наличие вирусных ДНК в опухолевой ткани было выявлено у 34 пациентов (21 мужчины и 13 женщин). Инфицирование ткани ВЭБ имело место в 27 случаях, ЦМВ - в 6, у 5 больных - ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 39, 45, 52, 59), в 1 случае выявлено наличие ВПГ 1, 2-го типа. ДНК нескольких вирусов (ВПЧ+ВЭБ, ВЭБ+ЦМВ, ЦМВ+ВЭБ+ВПЧ) была выявлена у 4 пациентов. Опухоли являлись низкодифференцированными в 56% случаев. В нашем исследовании ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 31, 45, 52, 59, 39-го типа) были выявлены у 8 больных. Пациенты эти были преимущественно «молодого» возраста, только 2 человека в возрасте 75 лет, остальные - от 46 до 66 (средний возраст 54,8 года). У 3 пациентов наличие ВПЧ сочеталось с наличием ВЭБ, в 1 случае - ЦМВ и ВЭБ. Начальная стадия заболевания имела место в 5 случаях, в остальных - стадия болезни соответствовала Т2-Т3N0M0. В 1 случае выявлено множественное поражение мочевого пузыря, у 2 больных опухоли были рецидивными. Низкодифференцированная опухоль выявлена в 50% случаев, в 1 случае имел место плоскоклеточный ороговевающий вариант рака мочевого пузыря. В соскобе из уретры у 3 мужчин и 2 женщин выявлен такой же тип ВПЧ, как и в опухоли. Наличие ВПЧ высокого онкогенного риска в опухоли коррелировало с выявлением других вирусов в опухоли (R=0,32, p=0,001) и имела место обратная корреляция с наличием лимфоцитов (R=-0,381, p=0,009). Выделение ВПЧ в соскобе из уретры слабо коррелировало с наличием ВЭБ в опухоли (R=0,189, p=0,038) и наличием в ней других вирусов (R=0,238, p=0,026), хотя данные статистически достоверны. У пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани мы выявили умеренные коррелятивные связи между наличием ВПЧ высокого онкогенного риска в опухолевой ткани и факторами апоптоза Bcl2 (R=0,386, p=0,215); рис. 1. Получены статистически достоверные высокие корреляционные связи между пролиферативной активностью и наличием ВПЧ высокого онкогенного риска в опухолевой ткани (R=0,706, p=0,05); рис. 2. Несмотря на то, что сочетанная инфекция с ВПЧ была выявлена только в 4 случаях, мы проанализировали пролиферативную активность опухоли мочевого пузыря при коинфекции ВПЧ высокого онкогенного риска и ВЭБ. По данным разных авторов, герпес-вирусы могут участвовать в канцерогенезе как кофакторы развития неоплазий различных локализаций [21-24]. Мы приводим данные пациента П. 64 лет (рис. 3, а) с наличием низкодифференцированной мышечно-инвазивной уротелиальной карциномы pT3N1M0 и сочетанной вирусной инфекции: положительным ВЭБ- и ЦМВ-инфекции в ткани опухоли методом ПЦР. Однако при морфологическом исследовании, несмотря на отсутствие ВПЧ в опухолевой ткани, методом ПЦР выявлены признаки как герпес-вирусной инфекции, так и ВПЧ (наличие койлоцитоза и внутриядерных включений). Препараты рассмотрены при разном увеличении. По нашим данным, медиана показателей пролиферативной активности клеток опухоли мочевого пузыря выше при наличии сочетанной вирусной инфекции (рис. 4). Следует отметить, что сочетанная вирусная инфекция имела место у пациентов с низкодифференцированными формами рака мочевого пузыря, при этом экспрессия Ki67 выше опять же у пациентов с наличием именно коинфекции с ВЭБ (рис. 5, 6). Несмотря на то, что сочетанная инфекция чаще встречалась у пациентов с начальными стадиями заболевания, экспрессия Ki67 была выше у пациентов с мышечно-неинвазивным раком при наличии сочетанной инфекции (рис. 7). На наш взгляд, это может свидетельствовать о появлении пролиферативной активности на этапе «премалигнизации», что, в свою очередь, способствует развитию неоплазий мочевого пузыря. Подобные данные были получены при исследовании сосудистого компонента опухолевой ткани (рис. 8, 9). Подсчитывались сосуды опухолевой ткани с окрашенным эндотелием, ув. 100 (Рlan10/0.25(160/0.17), в нескольких полях зрения подсчитывалось число окрашенных сосудов (общее число сосудов) и вычислялся процент по отношению ко всей исследуемой площади опухоли (соотношение числа сосудов к проценту площади опухоли). Экспрессия CD31 как такового, так и в зависимости от степени анаплазии была выше у пациентов с сочетанной коинфекцией, чем в ее отсутствие. Считается, что ВЭБ предрасполагает клетки, в частности молочной железы, к малигнизации через активацию HER2/HER3-сигнальных каскадов [22, 23]. HER2/HER3 - это мембранный белок, тирозиновая протеинкиназа семейства рецептора эпидермального фактора роста EGFR/ErbB [25]. Мы исследовали экспрессию EGFR у больных раком мочевого пузыря. Были выявлены умеренные и высокие коррелятивные связи между уровнем экспрессии EGFR у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани и наличием ВПЧ в опухоли (R=0,354, p=0,115), уровнем экспрессии р63 (R=0,707, p=0,182), p53 (R=0,499, p=0,025), Ki67 (R=0,747, p=0,05), а также уровнем анти-ВЭБ Ig-VCA (R=0,47, p=0,032). Если мы рассматриваем уровень экспрессии данного маркера только у пациентов с наличием ВЭБ в опухолевой ткани, то корреляционные связи усиливаются. В частности, корреляционные связи с уровнем противовирусных антител к ВЭБ анти-ВЭБ Ig-VCA (R=0,577, p=0,049), данные статистически достоверны. Также у этой группы больных определяются высокие корреляционные связи с наличием койлоцитоза (R=0,368, p=0,24) и внутриядерных включений (R=0,485, p=0,11) как проявлений ВПЧ-инфекции. Экспрессия ростового фактора (EGFR) в зависимости от степени анаплазии представлена на рис. 10, 11. Если рассматривать койлоцитоз как проявление ВПЧ-инфекции, то у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани выявлены высокие коррелятивные связи между койлоцитозом и экспрессией CD31 (общее число сосудов), R=0,576, p=0,008, CD31 (соотношение числа сосудов к проценту площади опухоли), R=0,47, p=0,036, экспрессией Ki67 (в баллах), R=0,408, p=0,316. Кроме того, у этой группы пациентов выявлены связи между наличием ЦМВ в опухолевой ткани и койлоцитозом (R=0,32, p=0,028), очаговой гиперплазией в виде фолликулов (R=0,362, p=0,012), а также наличием лейкоцитов (R=0,439, p=0,012) и эозинофилов (R=0,439, p=0,012). Следует отметить, что наличие койлоцитоза без подтвержденного методом ПЦР ВПЧ было выявлено и в группе пациентов с отсутствием вирусных ДНК в опухолевой ткани. При этом статистически достоверно наличие умеренно выраженных изменений (2 балла) было выше в группе пациентов именно с отсутствием вирусных ДНК (10,3% vs 28,6%, р=0,046), тогда как выраженные изменения (3 балла) имели место в большинстве случаев у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани (27,6% vs 9,5% соответственно, p=0,06). Такая же тенденция прослеживается и в случае наличия внутриядерных включений (1 балл: 10,7% vs 28,6%, р=0,046; 2-3 балла: по 17,9% vs 9,5% и 11,9% соответственно). Были выявлены умеренные корреляционные связи между наличием внутриядерных включений и наличием ВЭБ в опухолевой ткани (R=0,303, p=0,04), койлоцитозом (R=0,411, p=0,005), очаговой гиперплазией (R=0,459, p=0,001), периваскулярной инфильтрацией (R=0,335, p=0,023). Ранее в наших работах мы указывали на возможность сочетанной вирусной инфекции у этой категории больных [26]. Обсуждение Все больше появляется публикаций, посвященных потенцированию действия одних вирусов другими при неоплазиях различных локализаций [20-24]. Следует отметить, что способность вирусов потенцировать действие друг друга описана достаточно давно. Известно, что на фоне ЦМВ может развиваться инфицирование другими видами вирусов или бактериями, т.е. суперинфекция. Доказано, что ЦМВ инфицирует В-клетки, латентно инфицированные ВЭБ, более эффективно, чем ВЭБ-негативные [27]. В настоящее время обсуждается роль коинфекции, сочетанного действия вирусов, особенно ВПЧ и ВЭБ, на развитие неоплазий. A.Abudoukadeer и соавт. обнаружили статистически достоверное повышение выявляемости сочетанной ВПЧ+ВЭБ-инфекции по мере прогрессии рака шейки матки (r=0,46; p<0,01). Авторы указывают на определенную роль не только моноинфекции ВПЧ или ВЭБ, но и сочетанной инфекции как при возникновении, так и прогрессировании рака шейки матки [28]. Подобные данные получили и T.McCormick и соавт., при этом авторы указывают на нарушение процессов метилирования генов, в частности, RB1, именно при наличии коинфекции ВПЧ+ВЭБ - у 33,3% больных раком шейки матки. Авторы делают вывод о том, что ВЭБ является кофактором развития цервикальных неоплазий [21]. В нашей работе мы также выявили корреляционные взаимоотношения между морфологическими признаками ВПЧ и герпес-вирусными инфекциями: умеренные корреляционные связи были выявлены между наличием внутриядерных включений и наличием ВЭБ в опухолевой ткани (R=0,303, p=0,04), койлоцитозом (R=0,411, p=0,005), очаговой гиперплазией (R=0,459, p=0,001), периваскулярной инфильтрацией (R=0,335, p=0,023). Следует отметить, что экспрессия EGFR, особенно у пациентов с наличием ВЭБ, коррелировала также с уровнем анти-ВЭБ Ig-VCA (R=0,47, p=0,032), что свидетельствует о реактивации вирусной инфекции у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани, особенно при наличии ВЭБ. Кроме того, у этой категории больных выявлена корреляционная зависимость экспрессии ростовых факторов с наличием ВПЧ в опухолевой ткани (R=0,354, p=0,115), а у пациентов с наличием ВЭБ определялись корреляционные взаимодействия и с морфологическими признаками ВПЧ-инфекции - наличием койлоцитоза (R=0,368, p=0,24) и внутриядерных включений (R=0,485, p=0,11), однако данные статистически недостоверны. Обращают на себя внимание статистически достоверные коррелятивные связи экспрессии EGFR и пролиферативной активности (R=0,747, p=0,05), p53 (R=0,499, p=0,025) у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани, что, в свою очередь, приводит к неблагоприятному течению опухолевого процесса. Рассматривая вирусный канцерогенез рака шейки матки, S.Szostek и соавт. делают вывод о том, что герпес-вирусы (ЦМВ и ВЭБ) увеличивают риск появления интегрированного или смешанного генома ВПЧ 16-го типа и, соответственно, развития рака шейки матки: при сочетанной ЦМВ-инфекции - в 6 раз (ЦМВ: отношение шансов 6,069; 95% ДИ 1,91-19,22; p=0,002), при сочетанной ВЭБ-инфекции - в 7 раз (ВЭБ: отношение шансов 7,11; 95% ДИ 1,70-29,67; p=0,007). Авторы считают, что коинфекция ЦМВ, ВЭБ с ВПЧ высокого онкогенного риска способствует более быстрому развитию рака шейки матки [23]. В нашем исследовании наличие ЦМВ в опухолевой ткани коррелировало с очаговой гиперплазией в виде фолликулов (R=0,362, p=0,012), койлоцитозом (R=0,32, p=0,028), наличием лейкоцитов (R=0,439, p=0,012) и эозинофилов (R=0,439, p=0,012). При этом получены высокие корреляционные связи между пролиферативной активностью и наличием ВПЧ высокого онкогенного риска в опухолевой ткани (R=0,706, p=0,05), койлоцитозом и факторами неоангиогенеза (R=0,576, p=0,008) и маркерами пролиферации (R=0,408, p=0,316). R.Jiang и соавт. указывают на высокую (от 25 до 70%) выявляемость коинфекции ВПЧ+ВЭБ при раке ротоглотки и основания языка соответственно, ассоциированных с опухолевым статусом. In vitro авторы указывают на приобретение опухолью инвазивных свойств (p<0,01) при сочетанной инфекции. Кроме того, ассоциация вирусов была выявлена только в опухолевой ткани, богатой лимфоидными сосудами [20]. J.Lawson и соавт. в одном из своих последних исследований, посвященных влиянию онкогенных вирусов на развитие рака молочной железы, говорит о том, что влияние онкогенных вирусов в настоящее время является основной вероятной гипотезой развития рака молочной железы и прямого воздействия вирусов на клетки молочной железы [22]. При этом данная группа авторов в ранее проведенных исследованиях указывает на персистенцию онкогенных вирусов в ткани молочной железы, в частности ВПЧ у 13 (72%) из 17 больных в неизмененной ткани молочной железы и у 13 (76%) из 17 тех же самых пациенток, у которых впоследствии развился рак молочной железы, тогда как ВЭБ не был выявлен в здоровой ткани ни у одной пациентки, только в опухолевой ткани. При этом ВПЧ и ВЭБ были выявлены в одних и тех же клетках опухолевой ткани. Авторы подчеркивают, что наличие предшествующей вирусной инфекции (персистирующей в ткани от 1 до 11 лет до развития рака молочной железы) в ткани молочной железы до развития заболевания является ключевым критерием при оценке причинно-следственной связи персистенции онкогенных вирусов и развития рака молочной железы [24]. По всей видимости, персистирующая длительное время вирусная инфекция присутствует и у больных, страдающих раком мочевого пузыря, так как признаки вирусной инфекции в той или иной степени определяются у пациентов как с наличием, так и отсутствием вирусных ДНК в опухолевой ткани, определенных методом ПЦР. В последнем случае имеет место незначительная степень цитопатических изменений (2 балла: 10,3% vs 28,6%, р=0,046), тогда как при наличии вирусных ДНК степень этих изменений выше (3 балла: 27,6% vs 9,5% соответственно, p=0,06). Такая же тенденция прослеживается и в случае наличия внутриядерных включений (1 балл: 10,7% vs 28,6%, р=0,046; 2-3 балла: по 17,9% vs 9,5% и 11,9% соответственно). Заключение Таким образом, были проанализированы некоторые морфологические, а у ряда больных подтвержденные молекулярно-генетическими методами признаки наличия сочетанной вирусной инфекции, приведены клинические примеры. Признаки сочетанной вирусной инфекции в той или иной степени определяются как у пациентов с наличием, так и отсутствием вирусных ДНК в опухолевой ткани, определенных методом ПЦР. Выявляются корреляционные взаимосвязи между морфологическими, молекулярно-генетическими, иммуноферментными показателями наличия вирусной коинфекции у больных раком мочевого пузыря. Так, статистически достоверные коррелятивные связи мы получили между экспрессией EGFR и уровнем анти-ВЭБ Ig-VCA (R=0,47, p=0,032), пролиферативной активностью (R=0,747, p=0,05), p53 (R=0,499, p=0,025) у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани. Получены высокие корреляционные связи между пролиферативной активностью и наличием ВПЧ высокого онкогенного риска в опухолевой ткани (R=0,706, p=0,05); койлоцитозом и факторами неоангиогенеза (R=0,576, p=0,008). Повышение пролиферативной активности, экспрессии факторов апоптоза, ростовых факторов и факторов неоангиогенеза у пациентов с наличием вирусных ДНК в опухолевой ткани свидетельствует о неблагоприятном течении опухолевого процесса.

About the authors

I. V Kosova

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation; V.P.Demikhov City Clinical Hospital of the Department of Health of Moscow

Email: kosovainga@mail.ru
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1; 109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

O. B Loran

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: oleg_loran@gmail.com
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

L. A Sinyakova

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: l.a.sinyakova@mail.ru
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

L. V Gundorova

V.P.Demikhov City Clinical Hospital of the Department of Health of Moscow

Email: ludovik-213@mail.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

V. A Kosov

Komi Republican Oncology Center

Email: zinaidakosova@yandex.ru
167904, Russian Federation, Syktyvkar, p. Krasnozatonskij, Nyuvchimskoe sh., d. 46

I. E Pogodina

Vologda Regional Clinical Hospital №2

Email: utk-irina@yandex.ru
162602, Russian Federation, Cherepovets, ul. Danilova, d. 15

D. N Kolbasov

V.P.Demikhov City Clinical Hospital of the Department of Health of Moscow

Email: urology68@rambler.ru
109263, Russian Federation, Moscow, ul. Shkuleva, d. 4

References

Supplementary files