GENETIC POLYMORPHISM OF HAEMOSTASIS SYSTEM IN ISHEMIC STROKE PATIENTS IN KABARDINIAN AND BALKARIAN POPULATIONS

Full Text

Введение Инсульт является гетерогенным заболеванием и занимает 2-е место по распространенности причин смерти и инвалидизации во всем мире [1, 2]. Ишемический инсульт (ИИ) составляет около 80% случаев заболевания и 20% -геморрагические инсульты (ГИ) [1, 3]. Этническая и географическая вариабельность заболеваемости инсультом определяется многофакторностью и сложностью этиологии заболевания [4]. Помимо традиционных факторов риска, таких как артериальная гипертензия и диабет, в этиопатогенезе инсульта участвуют и генетические факторы, взаимодействующие с факторами внешней среды [5]. Отмечаются различия в факторах риска для разных типов ИИ [6, 7]. Гипертоническая болезнь вносит вклад в развитие атеросклероза и может способствовать возникновению ИИ [8]. Гиперлипидемия, приводящая к формированию атеросклероза экстракраниальных и интракраниальных кровеносных сосудов, является ключевым фактором риска инсульта [9]. Фибрилляция предсердий - основной фактор риска кардиоэмболического инсульта [10]. Частота встречаемости модифицируемых факторов риска инсульта также отличается в разных популяциях. В нескольких исследованиях продемонстрированы значительные различия по распространенности инсульта, образу жизни, связанному с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний, и соотношению факторов риска инсульта по этиологии в европеоидной, латиноамериканской, азиатской и афроамериканской популяциях [11, 12]. В афроамериканской, латиноамериканской и азиатской популяциях отмечается более высокая распространенность атеросклеротического поражения интракраниальных артерий [13]. Также высокая распространенность диабета и повышенного уровня холестерина отчасти позволяет объяснить полученные различия у афроамериканцев и латиноамериканцев, однако частично эти результаты могут быть связаны с не выявленными до настоящего времени генетическими факторами. Оценка распространенности инсульта в зависимости от этнической принадлежности в Российской Федерации особенно актуальна в связи с большим количеством национальностей, проживающих на территории страны. Сложная и гетерогенная природа инсульта затрудняет выявление генетических факторов риска в связи с ограниченными объемами выборки при анализе подтипов инсульта, а также необходимостью гармонизации определения и протоколов фенотипирования в рамках разных исследований [14, 15]. Целью настоящего исследования явилось изучение полиморфизмов генов системы гемостаза как предикторов развития ИИ в кабардинской и балкарской популяции. Материалы и методы В исследование были включены 176 пациентов с ИИ - 78 (44,3%) мужчин и 98 (55,7%) женщин, - которые проходили обследование и лечение в ГБУЗ «Республиканская клиническая больница» Кабардино-Балкарской Республики за период 2017-2018 гг. Среди обследованных пациентов 93 (52,8%) были кабардинцы и 83 (47,2%) - балкарцы. Средний возраст кабардинцев составил 65,4±9,6 года, а балкарцев - 66,1±9,8 года. Из исследования исключались пациенты с транзиторными ишемическими атаками и инсультом неизвестной этиологии. Контрольную группу составил 201 здоровый доброволец (101 кабардинец и 100 балкарцев), никто не имел кардиальной, акушерской патологии, тромбоэмболических эпизодов в анамнезе. Критерии включения в группы «пациенты»: • мужчины и женщины в возрасте 30-90 лет, проживающие на территории Кабардино-Балкарской Республики; • наличие верифицированного ИИ; • наличие подписанного пациентом или его родственниками информированного согласия на участие в исследовании. Критерии включения в группы «контроль»: • мужчины и женщины в возрасте 30-90 лет, проживающие на территории Кабардино-Балкарской Республики; • отсутствие ИИ/ГИ в анамнезе; • наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения из исследования для всех групп: • русская национальность; • беременность; • алкоголизм и наркомания; • острые или хронические психиатрические заболевания; • терминальные состояния. Характер инсульта устанавливался по данным компью-терной/магнитно-резонансной томографии, клинической картине, анамнестическим данным. Всем больным проводился комплексный клинико-инструментальный мониторинг, включающий оценку анамнеза, жалоб, соматического состояния, клинический и биохимический анализы крови. Оценка неврологического статуса проводилась по шкале NIHSS, функционального состояния и восстановления по модифицированной шкале Рэнкина. У всех пациентов осуществлялся анализ семейного и индивидуального анамнеза с уточнением всех возможных факторов риска. Все участники исследования (или их родственники) подписывали информированное согласие и заполняли анкеты, в которых необходимо было указать место рождения и этническое происхождение до третьего колена. Были включены только те пациенты, родственники которых родились и постоянно проживали на территории Кабардино-Балкарской Республики в течение трех поколений и относили себя к кабардинцам или балкарцам. Генетический анализ проведен на базе отдела молекулярных основ генетики человека ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН. Для выполнения анализа использовали препараты ДНК, полученные из 3 мл венозной крови. Выделение геномной ДНК осуществляли с использованием набора AxyPrep™ Blood Genomic DNA Midiprep Kit (Axygen, США) согласно рекомендациям производителя. Гены-кандидаты отобраны на основании их биологической роли в патогенезе ИИ и, в некоторых случаях, на основании ранее выявленных ассоциаций с риском ИИ [16, 17]. Были отобраны варианты генов тромбоцитарного гликопротеинового комплекса и b-субъединицы рецептора фибриногена тромбоцитов, участвующие в адгезии и агрегации тромбоцитов (GP1BA rs6065 и ITGB3 rs5918), а также b-полипептидной цепи белка фибриногена (FGB rs1800790). Полиморфные аллели генов ITGB3, GP1BA и FGB исследовали у всех пациентов и добровольцев методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием технологии TaqMan. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе StepOnePlus фирмы Applied Biosystems. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics version 23, программного обеспечения MS Excel 2000 (Microsoft) и программы GraphPad InStat3 (http://www.graphpad.com/), с помощью которой определяли величину критерия х2 и показателя отношения рисков. Достоверными считали значения p<0,05. Результаты Все участники исследования сопоставимы по полу и возрасту (табл. 1). Группы пациентов сопоставимы по наследственной отягощенности и коморбидной патологии. Обращают на себя внимание высокие показатели сахарного диабета (44,1 и 48,2% у кабардинцев и балкарцев соответственно) и ожирения (40,9 и 59,0% у кабардинцев и балкарцев соответственно) в группах пациентов, что, скорее всего, может быть связано с национальными особенностями популяций - большим употреблением жирной пищи (выпечка, баранина и т.д.). В группах здоровых добровольцев данные показатели были значимо ниже по сравнению с группой пациентов (p<0,05). Результаты генотипирования пациентов с ИИ представлены в табл. 2. У пациентов с ИИ в кабардинской популяции не получено достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей C/T полиморфного локуса гена ITGB3 с контрольной группой кабардинской популяции (для генотипов х2=1,790; p=0,409; для аллелей х2=1,82; p=0,192), т.е. rs5918 C>T полиморфизм гена ITGB3 не ассоциирован с риском развития ИИ в кабардинской популяции (отношение шансов - ОШ 0,67, 95% доверительный интервал - ДИ 0,38-1,2). В то же время у балкарцев с ИИ была повышена частота Т-аллеля, а в контрольной группе балкарской популяции наблюдалось повышение С-аллеля Таблица 1. Клинико-эпидемиологические характеристики популяции обследованных групп Table 1. Clinical and epidemiological characteristics of the studied groups Клинико-эпидемиологические характеристики Кабардинцы (n=201) Балкарцы (n=200) пациенты с ИИ (n=93) здоровые добровольцы (n=101) Р пациенты с ИИ (n=83) здоровые добровольцы (n=100) Р Возраст, лет (среднее ± SD [min; max]) 65,4±9,6 [37; 83] 59,0±11,5 [33; 89] >0,05 66,1±9,8 [45; 83] 59,5±13,1 [33; 87] >0,05 Пол (муж.:жен.) 41:52 44:57 >0,05 37:46 48:52 >0,05 Артериальная гипертензия 93 (100%) 89 (88,1%) >0,05 83 (100%) 91 (91,0%) >0,05 Сахарный диабет 41 (44,1%) 18 (17,8%) <0,05 40 (48,2%) 22 (22,0%) <0,05 Фибрилляция предсердий 17 (18,3%) 19 (18,8%) >0,05 15 (18,1%) 18 (18,0%) >0,05 Ожирение 38 (40,9%) 27 (26,7%) <0,05 49 (59,0%) 32 (32,0%) <0,05 Таблица 2. Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам генов ITGB3, GP1BA и FGB в группах пациентов с ИИ и контрольной группе Table 2. Distribution of genotypes and alleles frequencies by polymorphic loci of ITGB3, GP1 BA and FGB genes in the groups of patients with IS and in the control group Варианты генотипов и аллелей Кабардинцы Балкарцы пациенты с ИИ здоровые добровольцы Р пациенты с ИИ здоровые добровольцы Р n=93 частота, % n=101 частота,% n=83 частота, % n=100 частота,% ITGB3 rs5918 C>T C/C 65 69,9 79 78,2 0,409 55 66,3 80 80,0 0,211 C/T 25 26,9 20 19,8 24 28,9 18 18,0 T/T 3 3,2 2 1,98 4 4,8 2 2,0 C 155 83,3 178 88,1 0,192 134 80,7 178 89,0 0,037 T 31 16,7 24 11,9 32 19,3 22 11,0 GP1BA rs6065 C>T C/C 61 65,6 80 79,2 0,048 55 66,3 79 79,0 0,261 C/T 28 30,1 20 19,8 25 30,1 20 20,0 T/T 4 4,3 1 0,99 3 3,6 1 1,0 C/C 61 65,6 80 79,2 0,037 55 66,3 79 79,0 0,065 C/T+ T/T 32 34,4 21 20,8 28 33,7 21 21,0 C 150 80,6 180 89,1 0,022 135 81,3 178 89,0 0,05 T 36 19,4 22 10,9 31 18,7 22 11,0 FGB rs1800790 G>A G/G 38 40,9 55 54,5 0,08 34 41,0 50 50,0 0,241 G/A 49 52,7 44 43,6 43 51,8 47 47,0 A/A 6 6,5 2 1,98 6 7,2 3 3,0 A 61 32,8 48 23,8 0,05 55 33,1 53 26,5 0,170 G 125 67,2 154 76,2 111 66,9 147 73,5 (Х2=4,94; p=0,04), т.е. аллель T ассоциирован с риском развития ИИ в балкарской популяции (ОШ 0,52, 95% ДИ 0,29-0,93). Различий в частоте распределения генотипов балкарцев с ИИ и контрольной группой не выявлено (Х2=3,113; p=0,211). При оценке результатов генотипирования rs6065 C>T полиморфного локуса гена GP1BA у больных с ИИ в кабардинской популяции по сравнению с контрольной группой выявлено, что у лиц с генотипом С/С наблюдается снижение риска развития ИИ по сравнению с носителями генотипов С/Т и Т/Т (ОШ 2,0, 95% ДИ 1,05-3,8), чего не наблюдалось в популяции балкарцев (ОШ 1,92, 95% ДИ 0,99-3,71). При оценке распределения частот аллелей установлено, что у пациентов с ИИ как среди кабардинцев, так и балкарцев чаще встречается Т-аллель по сравнению с контрольной группой (для кабардинцев х2=5,46; p=0,022; для балкарцев х2=4,31; p=0,05), т.е. носительство Т-аллеля ассоциировано с риском развития ИИ как в кабардинской (ОШ 0,51, 95% ДИ 0,29-0,9), так и в балкарской (ОШ 0,54, 95% ДИ 0,3-0,97) популяциях. При изучении распределения частот генотипов по G/A полиморфизму гена FGB в популяции кабардинцев и балкарцев между пациентами с ИИ и контрольной группой, а также между выборками больных с ИИ не установлено достоверных различий (для кабардинцев Х2=5,06; p=0,08; для балкарцев х2=2,84; p=0,241). Однако у кабардинцев носительство A-аллеля было сопряжено с риском развития ИИ (ОШ 1,57, 95% ДИ 1,0-2,45), чего не наблюдалось в популяции балкарцев (ОШ 1,37, 95% ДИ 0,88-2,16). Обсуждение Исследования генов-кандидатов, влияющих на систему гемостаза, в том числе у пациентов с инсультом, являются актуальными и востребованными. ITGB3 - основная рецепторная область для фибриногена. Имеющиеся данные указывают на то, что его участие в агрегации тромбоцитов повышает тромбообразование либо за счет изменения связывания лигандов, либо за счет изменения пострецепторной передачи сигнала. Замена rs5918 T-на-С на уровне нуклеотида 1565 приводит к замещению аминокислоты 33 пролина на лейцин с возникновением многочисленных конформационных изменений рецептора ITGB3 [18]. Результаты исследований противоречивы и не позволяют установить, приводят ли эти конформационные изменения к повышению или снижению связывания с иммобилизованным фиброногеном и влиянию на ретракцию фибринового сгустка [19]. Можно предположить, что аллель ITGB3 rs5918 С играет роль в этиологии инсульта, так как обнаружена его взаимосвязь с повышением риска инсульта в других исследованиях [20]. Однако нам не удалось продемонстрировать взаимосвязь ITGB3 с частотой возникновения ИИ в рамках нашего исследования ни в кабардинской, ни и в балкарской популяции. Ген GP1BA кодирует субъединицу GPIba тромбоцитарного комплекса гликопротеина GPIb-IX, который состоит из четырех трансмембранных полипептидов, GPIba ди-сульфидно связан с GPIbp, а GPIX и GPV нековалентно связаны с комплексом в стехиометрическом соотношении 2:4:2 [17]. Субъединица GPIba на N-концевом домене несет сайт связывания для фактора фон Виллебранда (VWF), взаимодействие с которым является ключевым для первичного гомеостаза и образования тромба. Нам удалось установить, что генотипы С/Т и Т/Т ассоциированы с повышенным риском развития ИИ в кабардинской популяции. Фибриноген представляет собой гликопротеин, состоящий из a-, b- и g-цепей и являющийся ключевым фактором свертывания крови. Он играет важную регулирующую роль в процессе тромбообразования [16]. Данный белок кодируется тремя различными генами, расположенными в локусах q23-q32 на хромосоме 4 [21]. Ранее проведенные исследования продемонстрировали, что полиморфизмы 148 С/T и 455 G/A P-цепи фибриногена (FGb) могут влиять на концентрацию фибриногена в плазме. Эти два полиморфизма связаны с повышением риска тромботических осложнений [22, 23]. В настоящее время предполагается центральная роль процесса тромбообразования в патогенезе ИИ. Нами продемонстрировано, что наличие А-аллеля сопряжено с развитием ИИ в кабардинской популяции. Дальнейшие исследования по изучению взаимосвязи полиморфных вариантов различных генов, которые участвуют в контроле патофизиологических процессов, связанных с риском развития инсульта в различных популяциях, дадут возможность понять причины и механизмы развития заболевания, а также разработать скрининговые молекулярно-генетические тесты для определения риска его развития в отдельных популяциях с последующей разработкой профилактических мероприятий. Выводы Таким образом, в результате впервые проведенного исследования генетических особенностей в кабардинской и балкарской популяциях выявлены достоверные ассоциации между различными вариантами аллельного полиморфизма генов GP1BA (rs6065), FGB (rs1800790) с развитием ИИ в популяции кабардинцев. Для полиморфизмов генов ITGB3 (rs5918) и FGB (rs1800790) получены значимые различия в распределении минорных аллелей. Для популяции балкарцев не выявлено достоверных связей изученных полиморфизмов с риском развития ИИ. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. The authors declare that there is not conflict of interests.

About the authors

Liana T. Khasanova

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: kabarda_89@mail.ru

Petr A. Slominskiy

Pirogov Russian National Research Medical University; institute of Molecular Genetics

Liudmila R. Laypanova

Pirogov Russian National Research Medical University

Dinara T. Chipova

City Clinical Hospital №1, Nalchik

Email: kabarda_89@mail.ru

Vera L. Shomahova

Republican Clinical Hospital, Nalchik

Nikolai A. Shamalov

Federal Center for Cerebrovascular Pathology and Stroke

References

Supplementary files