A study of the potential of medicinalplant extracts in suppression of SARS-CoV-2 replication: a pilot study

Full Text

Введение Масштабность распространения и тяжесть клинических проявлений инфекции, инициированной SARS-CoV-2, стали причинами пандемии и чрезвычайной ситуации международного значения в общественном здравоохранении. По имеющимся данным, уже 10 февраля 2020 г. во всем мире зарегистрировано более 107 млн подтвержденных случаев инфекции и более 2,34 млн летальных исходов [1]. Известно, что COVID-19 поражает главным образом респираторную систему, что может проявляться тяжелым или крайне тяжелым поражением легких, развитием дыхательной недостаточности, острого респираторного дистресс-синдрома. Вместе с тем частыми клиническими проявлениями инфекционного процесса признаны и легкие/умеренно выраженные гриппоподобные симптомы - лихорадка, кашель, миалгия, боль в горле, нарушение обоняния и осязания [2, 3]. Многочисленные научные, экспериментальные и клинические исследования, проводимые учеными во всем мире, сосредоточены в настоящее время не только на создании безопасных и эффективных вакцин [4], но и на разработке методов лекарственной терапии [5], способных как оказывать специфическое воздействие на вирусные или клеточные структуры-мишени, так и обеспечивать неспецифическое влияние - облегчать тяжесть/выраженность клинической симптоматики, ассоциированной с SARS-CoV-2, обладая при этом благоприятным профилем безопасности. В этой связи невозможно не отметить значимость лекарственных средств растительного происхождения с подтвержденной эффективностью и безопасностью, широко использующихся в комплексной терапии заболеваний, в том числе инфекционного генеза. Одно из доказательств признания ценности препаратов растительного происхождения -присуждение Нобелевской премии по медицине и физиологии за открытие артемизинина - препарата, обладающего эффективным действием в отношении возбудителя тропической малярии, полученного из полыни однолетней [6]. В работах, посвященных исследованию терапевтического потенциала лекарственных растений, встречаются и данные об их многообещающей противовирусной активности [7], способностях влиять на различные стадии репликации вируса и/или стимулировать процессы регенерации, модулировать иммунный ответ организма-хозяина. Кроме того, содержащиеся в растениях биологически активные вещества - флавоноиды, терпеноиды, полисахариды и гликозилированные продукты метаболизма, определяющие разносторонний характер действия лекарственных растений, - широко применяются в современной медицине, в том числе при заболеваниях респираторного тракта, благодаря наличию у них противовоспалительного или противовирусного действия. В растительных экстрактах (РЭ), состоящих из множества молекулярных компонентов, механизмы противовирусного действия могут сочетаться, оказывая дополнительный или даже синергический эффект [8]. Активные составляющие хорошо известных и давно присутствующих на фармацевтическом рынке растительных лекарственных препаратов обладают противовирусной активностью или стимулируют механизмы противовирусной защиты [9-11]. Так, в рандомизированном клиническом исследовании показана безопасность и хорошая переносимость препарата Тонзилгон® Н у детей с острым вирусным тонзиллитом [8, 12], в других работах продемонстрированы преимущества этого фитопрепарата как в отношении облегчения симптомов у пациентов, инфицированных вирусом Эпштейна-Барр [12], так и в подавлении репликации респираторно-синцитиального вируса в культуре клеток и у лабораторных животных [13]. Применение препарата Синупрет® экстракт (BNO-1016) эффективно в качестве средства симптоматической терапии острого ри-носинусита. Препарат способствует значительному уменьшению выраженности симптомов, характеризуясь при этом сравнимой с плацебо частотой нежелательных явлений [14-18]. В исследовании in vitro продемонстрирована его противовирусная активность в отношении ряда респираторных вирусов человека, включая вирус гриппа A и респираторно-синцитиальный вирус [19]. Исследуемые в настоящей экспериментальной работе безрецептурные лекарственные препараты хорошо изучены и производятся из растительного сырья с помощью инновационных технологических методов. Эти препараты содержат предельно точные композиции действующих веществ, имеют благоприятный профиль безопасности и предназначены для лечения заболеваний дыхательных путей. Тем не менее ни один из этих растительных препаратов не изучался на предмет их потенциальной активности в отношении SARS-CoV-2 - наиболее актуального в настоящее время респираторного патогена. Авторами публикации представлены данные пилотных экспериментов, в которых in vitro оценивался потенциал различных РЭ в отношении подавления репликации вируса SARS-CoV-2. Материалы и методы Экстракты Исследованы следующие препараты (производитель «Бионорика СЕ», Ноймаркт-ин-дер-Оберпфальц, Германия): Бронхипрет® (БРО). Активные вещества: трава тимьяна (Thymus vulgaris L. или Thymus zygis L.) и плюща вьющегося листья (Hedera helix L.). Смесь жидких экстрактов травы тимьяна [экстракционный растворитель (ЭР): раствор аммиака 10% (m/m)/ глицерин 85% ^^^этанол 90% (у/у)/вода (1:20:70:109); коэффициент экстракции (КЭ): 1:2-2,5] и листьев плюща вьющегося [ЭР этанол 70% (v/v); КЭ: 1:1] аналогично сиропу Бронхипрет®, с соотношением жидких экстрактов тимьяна и плюща - 10:1. С целью минимизации содержания этанола в тест-системе смесь экстрактов деалкоголизирова-ли ротационным выпариванием до конечного содержания этанола 1% (v/v). Для контроля потери летучих компонентов с концентратом проведены специальные испытания на подлинность. Бронхипрет® ТП (БРО ТП). Активные вещества: трава тимьяна (Thymus vulgaris L. или Thymus zygis L.) и корень примулы [Primula veris L. или Primula elatior (L.) Hill]. Смесь натуральных сухих экстрактов травы тимьяна [ЭР: этанол 70% (v/v); КЭ: 6-10:1] и корня примулы [ЭР: этанол 47% (v/v); КЭ: 6-7:1 ], аналогичных содержащимся в препарате Бронхипрет® ТП, в форме таблеток, покрытых пленочной оболочкой, без вспомогательных веществ, с конечным соотношением сухих экстрактов тимьяна/примулы - 2,67:1. Тонзилгон® Н (ТОН). Активные вещества: корень алтея лекарственного (Althaea officinalis L.), цветки ромашки (Matricaria recutita L.), трава хвоща (Equisetum avense L.), листья грецкого ореха (Juglans regia L.), трава тысячелистника (Achillea millefolium L.), кора дуба (Quercus robur L.), трава одуванчика (Taraxacum officinale F.H. Wiggers). В 100 г капель для приема внутрь содержится 29 г водно-спиртового экстракта (ЭР с объемной долей этанола 59%, смесь лекарственного растительного сырья: корень алтея лекарственного 0,4 г, цветки ромашки 0,3 г, трава хвоща 0,5 г, листья грецкого ореха 0,4 г, трава тысячелистника 0,4 г, кора дуба 0,2 г, трава одуванчика 0,4 г. Общее содержание этанола - 19%. С целью минимизации его содержания в тест-системе смесь РЭ деалкоголизировали [>0,5%, (v/v)] ротационным выпариванием. Качество де-алкоголизированного испытуемого образца по показателю «Количественное определение» соответствовало требованиям для препарата Тонзилгон® Н в форме капель для приема внутрь, что подтверждено результатами испытаний на подлинность и количественным анализом. Синупрет® экстракт (СИНэ). Активные вещества: корень горечавки (Gentiana lutea L.), цветки примулы (Primula veris L.), трава щавеля (Rumex crispus L.), цветки бузины (Sambucus nigra L.), трава вербены (Verbena officinalis L.). Комбинированный натуральный сухой экстракт (BNO 1011) корня горечавки, цветков примулы, травы щавеля, цветков бузины, травы вербены в соотношении 1:3:3:3:3 [ЭР: этанол 51% (v/v); КЭ: 3-6:1], аналогично препарату Синупрет® экстракт, таблетки, покрытые оболочкой, без вспомогательных веществ. Тонзипрет® (ТОП). Активные вещества: экстракт перца кайенского (Capsicum annuum L), экстракт гваякового дерева (Guaiacum officinale L./Guaiacum sanctum L.) настойка лаконоса американского (Phytolacca americana L.). Гомеопатический препарат для лечения боли в горле, в форме таблеток для рассасывания, содержащий экстракты перца кайенского 37,5% в разведении D3, гваякового дерева 37,5% в разведении D3, матричную настойку лаконоса американского 25,0%. С целью минимизации содержания этанола в тест-системе смесь деалкоголизирована [>0,5% (v/v)] ротационным выпариванием, при этом качество деалкоголизированного испытуемого образца соответствовало требованиям для производства растительного лекарственного препарата Тонзипрет®, что подтверждено результатами испытаний на подлинность. Концентрация этанола в экстрактах БРО, ТОН и ТОП была доведена до 0,37%. Концентрация экстрактов, входящих в состав БРО ТП и СИНэ, - до 100 мг/мл. РЭ центрифугированы со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин и стерилизованы путем фильтрации (диаметр пор фильтра - 0,22 мкм). С целью получения исходного раствора для экспериментов концентрация этанола доведена до 0,37% с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (Ф-СБР). Для экспериментов были подготовлены двукратные серийные разведения соответствующего исходного раствора в разведении 1:10 до получения разведения 1:2560 в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbeccos Modified Eagles Medium - DMEM); для контроля в качестве растворителя использовали этанол той же концентрации, что и в испытуемых образцах. Клетки и вирусы В качестве клеток-хозяев для выращивания вируса использовались клетки Веро [20], в соответствии со стандартными процедурами культивируемые в среде DMEM, в атмосфере c содержанием 5% CO2, при температуре 37°С. Клетки засевались в 96-луночные планшеты и инфицировались изолятом SARS-CoV-2 при множественности заражения 0,05 в течение 24 ч в присутствии одного из РЭ (в серийных двукратных разведениях) или растворителя, используемого для контроля. Перед сбором супернатантов клеточных культур и определением вирусной РНК (методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией в реальном времени [21], с использованием системы StepOnePlus™ - Thermo Fisher Scientific - с фаговыми частицами MS2 для экзогенного внутреннего контроля) клетки инкубировали в течение 24 ч в присутствии РЭ. Токсичность экстрактов оценивалась в течение 48 ч с помощью колориметрического теста [22]. Полумаксимальную ингибирующую (Inhibition Concentration - IC50) и полумаксимальную цитотоксическую концентрации (Cytotoxic Concentration -CC50) определяли с помощью GraphPadPrism (версия 8.4.2). Значимой считалась токсичность >50%. Для оценки инактивации вируса вне клеток исходное разведение вируса SARS-CoV-2 (100 мкл), содержащее 4 тыс. бляшкообразующих единиц, инкубировали при комнатной температуре с выбранными РЭ (100 мкл) в течение 15 или 60 мин (инкубация в течение 60 мин выступала в качестве контроля). Инкубирование прекращали добавлением 800 мкл DMEM с последующим титрованием на клетках Веро. Лунки промывали через 120 мин после заражения и вновь инкубировали в отсутствие РЭ на протяжении 48 ч. Титры измерялись количественно, путем определения инфицирующей дозы в культуре ткани (Median Tissue Culture Infectiouse Dose - TClD50) [23]. Статистика Статистические расчеты выполнялись с использованием логарифмически трансформированных данных вирусной нагрузки в супернатантах клеточных культур, сравниваемых с разведением 1:2560. Проводился однофакторный дисперсионный анализ с повторным измерением и множественным сравнением Даннета. Значимым считали уровень p>0,05. Результаты В ходе эксперимента установлено, что высокие концентрации РЭ оказывали дозозависимое токсическое воздействие (табл. 1). Оценка противовирусной активности РЭ при нецитотоксических концентрациях (рис. 1) показала, что БРО и СИНэ не оказывали существенного влияния на снижение количества копий вирусной РНК. В то же время ее Рис. 1. Снижение количества копий РНК SARS-CoV-2 под действием РЭ. БРО БРО ТП ТОН Таблица 1. Цитотоксичность РЭ в клетках Веро. CC50, определенная с помощью колориметрического теста Препарат Неинфицированные клетки Инфицированные клетки БРО 1:174 1:153 БРО ТП 1:153,5 (651 мкг/мл) 1:156,7 (638 мкг/мл) ТОН 1:94,6 1:73,8 СИНэ 1:58,9 (1698 мкг/мл) 1:52,6 (1901 мкг/мл) ТОП 1:17 1:6,75 Растворитель этанол 1:6,3 1:1,73 снижение примерно на один порядок (в 10 раз) наблюдалось под действием ТОП и ТОН в максимальной нецитотоксической концентрации (<CC50). Воздействие и ТОП, и ТОН приводило к угнетению репликации вирусной РНК до 87%, что сходно со снижением вирусной нагрузки, наблюдаемой при действии ЭР (этанола) в самом низком его разведении. Применение БРО ТП способствовало снижению количества копий вирусной РНК SARS-CoV-2 в 1 тыс. раз в зависимости от концентрации в нецитотоксическом диапазоне, что свидетельствует о наличии у него существенной противовирусной активности (см. рис. 1). Для выяснения того, обусловлена ли данная активность БРО ТП прямой инактивацией вируса (в сравнении с ТОН и ТОП), SARS-CoV-2 инкубировали с этими РЭ в течение 60 мин. Полученные данные свидетельствовали о снижении титров вируса (в зависимости от времени): до 38% при контакте с БРО ТП, до 59% - с ТОН и до 65% при воздействии ТОП в сравнении с инкубацией в Ф-СБР в течение 60 мин (табл. 2), что указывает на потенциальную вирулицидную активность РЭ, но не объясняет мощной противовирусной активности БРО ТП при культивировании с инфицированными клетками Веро. Представлены средние значения трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего (Standart Error of Mean - SEM). Символ f - концентрации экстрактов >CC50. БРО ТП и СИНэ: концентрация исходного раствора - 100 мг/мл, концентрация в ходе анализа - 10 мг/мл (разведение 1:10), 5 мг/мл (1:20), 2,5 мг/мл (1:40), 1,25 мг/мл (1:80), 625 мкг/мл (1:160), 312,5 мкг/мл (1:320), 156,25 мкг/мл (1:640), 78 мкг/мл (1:1280) и 39 мкг/мл (1:2560) соответственно. Обсуждение Потенциал активности лекарственных средств растительного происхождения в отношении SARS-CoV-2 и купирования клинических проявлений COVID-19 очень мало изучен. В первых клинических рекомендациях, разработанных в Китайской Народной Республике и посвященных как лечению больных, так и мероприятиям по сдерживанию новой пандемии, позиционировалось использование традиционных лекарственных средств, включая препараты растительного происхождения [24]. Один из примеров растительного компонента, обладающего несомненной активностью в отношении вируса, -микро-РНК, экстрагированная из жимолости и способная угнетать репликацию SARS-CoV-2 [25]. Другие исследования метаболитов растений ограничивались главным образом экспериментами in silico - компьютерное моделирование эксперимента с использованием метода молекулярного моделирования (молекулярный докинг) для оценки потенциальной ингибирующей активности хорошо изученных молекул растительного происхождения в отношении вирусных факторов [26-28]. К сожалению, в настоящее время экспериментальные подтверждения противовирусной активности таких метаболитов растительного происхождения практически отсутствуют. Представленные результаты пилотных экспериментов свидетельствуют о том, что валидированные экстракты ле- Таблица 2. Инактивация вне клеток по титрам SARS-CoV-2. Титры SARS-CoV-2 после инкубации с РЭ в течение указанного времени. Значения выражены в процентах от титра после обработки Ф-СБР в течение 1 ч (=100%) Препарат 15 мин 1 ч БРО ТП, % 88 62 ТОН, % 60 41 ТОП, % 70 35 карственных растений, в частности БРО ТП и, в меньшей степени, ТОН и ТОП, способны препятствовать репликации SARS-CoV-2 в клетках Веро. Другие исследованные РЭ - БРО и СИНэ - не продемонстрировали заметного влияния на число копий вирусной РНК. Таким образом, все РЭ различались по своей потенциальной противовирусной активности в культуре клеток, что позволяет предположить наличие у них избирательной специфичности эффектов. Воздействие ЭР приводило к умеренному снижению количества копий вирусной РНК в максимальной исследованной концентрации (разведение исходного раствора 1:10, что соответствует 0,037% этанола). То, что эта концентрация значительно превышала СС50 каждого из исследуемых РЭ, с высокой вероятностью исключает допустимость того, что противовирусное действие обусловлено растворителем. Факт того, что прямая инактивация вируса РЭ была неполной после инкубации в течение 60 мин, свидетельствует в пользу того, что противовирусный эффект БРО ТП в основном обусловлен влиянием на репликацию вируса и/или на клеточный механизм репликации. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что отдельные препараты РЭ обладают определенным потенциалом в отношении угнетения репликации SARS-CoV-2 in vitro. Принимая во внимание то, что препараты растительного происхождения широко применяются в клинической практике для симптоматической терапии различных поражений респираторного тракта (ринит, риноси-нусит, тонзиллит, тонзиллофарингит, острый бронхит) [14, 16, 29, 30-37] и к тому же обладают противовоспалительным действием, можно предполагать, что их клинические эффекты, безусловно, востребованы при лечении респираторных симптомов, инициируемых SARS-CoV-2 [17, 30-36, 38]. По мнению авторов, в ближайшей перспективе идентификация молекул растительного происхождения может помочь в выявлении новых механизмов действия и терапевтических целей в лечении инфекционных поражений, ассоциированных с SARS-CoV-2. Пример тому - активные компоненты корня примулы, представляющие особый интерес для последующего более детального и пристального изучения [31-33]. Кроме того, независимые клинические исследования эффективности БРО и БРО ТП продемонстрировали их сопоставимую эффективность в лечении острого бронхита [31, 38]. Препараты, исследованные в рамках описанных экспериментов, различаются по составу и содержат ряд потенциально активных органических веществ - флавоноидов, терпеноидов и полисахаридов. С учетом того, что до настоящего времени непосредственные молекулярные механизмы угнетения репликации SARS-CoV-2 не определены, противовирусная активность растительных компонентов может быть объяснена связыванием некоторых из них с вирусными белками, что препятствует проникновению вируса в клетку или его репликации. Кроме того, нельзя исключить и наличие потенциала прямого вирулицидного действия (в особенности у ТОП и ТОН). Важно отметить, что метаболиты (лютеолин, кверцитин или апигенин), содержащиеся в исследованных РЭ [39], способны связываться с ангиотензинпревращающим ферментом-2 - местом прикрепления коронавируса к поверхности клетки - или с вирусными белками, например главной протеазой, и тем самым препятствовать проникновению вируса в клетку или угнетать его репликацию [26-28]. Поскольку исследованные растительные лекарственные препараты содержат множество активных метаболитов, велика вероятность того, что их компоненты нацелены на разные стадии репликации вируса и могут действовать синергически. Кроме того, противовирусная активность может быть обусловлена и благоприятной модуляцией иммунного ответа, способствующей уменьшению выраженности клинической симптоматики. Безусловно, подобные иммуномодулирующие эффекты чрезвычайно сложно оценить, используя лишь модели клеточных культур. Заключение Невозможность переноса результатов, полученных на культуре клеток, в реальные клинические условия - значимое ограничение проведенных пилотных экспериментов, поэтому авторы полагают, что необходимо продолжение исследовательской работы для детального выяснения потенциала растительных лекарственных средств в отношении SARS-CoV-2, ведь умеренный противовирусный эффект в культуре клеток in vitro in vivo может проявляться более выраженно. Тем не менее полученные результаты - несомненно первые доказательства того, что РЭ обладают потенциалом в отношении угнетения активности SARS-CoV-2 и, вполне вероятно, способны облегчать клинические проявления COVID-19 и предотвращать развитие осложнений. Конфликт интересов. A.G., A.R., M.D.P., P.S. и B.S. заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. A.G., A.R., M.D.P., P.S., and B.S. declare no conflict of interest. Финансирование. Компания «Бионорика СЕ» принимала участие в разработке исследования и подготовке рукописи, но не в сборе, анализе и интерпретации данных. Funding. Bionorica SE was involved in the study design and manuscript preparation, but not in the data collection, analysis, and interpretation.

About the authors

Michela Luisa De Pellegrin

Institute of Clinical Microbiology and Hygiene, University Hospital Regensburg

Regensburg, Germany

Anette Rohrhofer

institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Regensburg

Regensburg, Germany

Philipp Schuster

Institute of Clinical Microbiology and Hygiene, University Hospital Regensburg

Regensburg, Germany

Barbara Schmidt

Institute of Clinical Microbiology and Hygiene, University Hospital Regensburg; institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Regensburg

Regensburg, Germany

Philipp Peterburs

Bionorica SE, KerschensteinerstraBe 11-15, 92318

Email: philipp.peterburs@bionorica.de
Neumarkt, Germany

Andre Gessner

Institute of Clinical Microbiology and Hygiene, University Hospital Regensburg; institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Regensburg

Regensburg, Germany

References

Supplementary files