Sovremennye metody diagnostiki naibolee rasprostranennykh infektsiy, peredavaemykh polovym putem

Full Text

В последнее десятилетие прошлого века лабораторная диагностики ряда инфекции, передаваемых половым путем (ИППП), в том числе сифилиса, гонореи, трихомониаза, хламидиоза, вышла на качественно новый уровень, что позволило в подавляющем большинстве случаев проводить адекватное обследование пациентов, оценивать эффективность проводимой терапии и прогнозировать течение заболевания. Это связано с созданием новых технологий (ДНК-диагностика, ферментспецифические, иммунохроматографические тесты) и разработкой показаний к применению уже известных и используемых в других областях науки и практики методов исследований: иммуноферментного анализа, реакции иммунофлюоресценции, гемагглютинации и др. В лабораторной диагностике ИППП создалась достаточно своеобразная ситуация: с одной стороны, появилось значительное количество разнообразных тест-систем, диагностикумов, питательных сред, с другой - большая часть из них не зарегистрирована и не регламентирована для проведения исследований при детекции тех или иных возбудителей, нет четких показателей к использованию, кратности применения. Условно все методики диагностики ИППП могут быть разделены на: микроскопические, включающие флюоресцентную, светооптическую и темнопольную микроскопию; серологические - комплекс серологических реакций (КСР), состоящий из реакции микропреципитации (РМП) и ее модификаций VDRL, RPR, Trust и др., и реакции связывания (фиксации) комплемента (РСК), реакция иммунофлюоресценции (РИФ-абс и РИФ-200), реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ), иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА); методы культуральной диагностики, в том числе и культуры клеток (тканей); ДНК-диагностика - ДНК-гибридизация, ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция (ПЦР), а также лигазная реакция (ЛЦР), которая в России не используется; ферментспецифические и иммунохроматографические тест-системы. Сифилис Возбудитель сифилиса - Treponema pallidum в отличие от других микроорганизмов не культивируется на питательных средах in vitro, а также с трудом определяется при окраске (Г.А.Дмитриев, Е.Е.Брагина, 1996; R.Wilcox, T.Guthe и др.). Все существующие в настоящее время лабораторные методы детекции Tr. pallidum подразделяются на прямые (микроскопия в темном поле и метод заражения кроликов) и непрямые (серологические тесты для выявления антител). Использование метода заражения бледной трепонемой кроликов, несмотря на его высокую чувствительность, весьма ограничено из-за длительности получения результата и высокой стоимости. Он практически не используется в настоящее время. Прямая визуализация трепонем методом темнопольной микроскопии является убедительным доказательством трепонемной природы заболевания. Наиболее эффективен этот метод при первичном и вторичном сифилисе, при наличии поражений кожи и слизистых. Вместе с тем отрицательный результат, обусловленный различными факторами, не является основанием для исключения диагноза сифилиса и требует дальнейшего подтверждения методами серологической диагностики. Кроме того, с помощью этого метода невозможно наблюдать за динамикой инфекционного патологического процесса и оценивать эффективность терапии. В настоящее время доминирующая роль в лабораторной диагностике сифилиса принадлежит серологическим методам исследования (приказ №87 от 26.03.2001 Минздрава РФ "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса"). В качестве скрининговых (отборочных) методов используются РМП с кардиолипиновым антигеном, РСК с кардиолипиновым антигеном, которые не являются специфическими и в ряде случаев, особенно при первичном сифилисе, могут давать ложноположительные результаты. РИТ и РИФ обладают более высокой чувствительностью (74-94% и 84-99%) и специфичностью (99 и 97% соответственно) и применяются для подтверждения результатов отборочных реакций, распознавания ложноположительных результатов РМП и РСК, а также установления ретроспективного диагноза сифилиса. Недостатками этих методов являются техническая сложность, длительность постановки, субъективизм в оценке результатов, высокая стоимость исследования, необходимость высококвалифицированных сотрудников. Следует учитывать, что, по данным ряда авторов (О.К.Лосева, А.Н.Ловенецкий, 2000), приблизительно у 85% адекватно пролеченных больных трепонемные тесты остаются положительными в течение нескольких лет и даже в течение всей жизни и поэтому не могут быть использованы в качестве контроля излеченности. В последние годы в отечественную медицинскую практику внедряются высокоинформативные, стандартизированные методы диагностики сифилиса: ИФА, хорошо зарекомендовавший себя при диагностике многих инфекционных заболеваний и РПГА. Тест-системы для диагностики сифилиса сертифицированы и регулярно контролируются соответствующими организациями. Эти методы могут использоваться как в качестве отборочных (простота постановки, возможность автоматического учета и быстрота получения результатов при исследовании огромного количества проб), так и подтверждающих (превосходят по чувствительности, специфичности, воспроизводимости КСР и не уступают РИТ и РИФ). С учетом этих обстоятельств, а также с целью унификации методов обследования пациентов с подозрением на сифилис приказом №87 Минздрава РФ рекомендовано к 2006 г. осуществить переход на новый комплекс серологических реакций, включающих ИФА или РПГА в сочетании с РМП или ее модификацией в количественном варианте. К сожалению, все методы серологической диагностики сифилиса основаны на косвенном показателе наличия Tr. pallidum - антительном ответе на бледную трепонему в крови пациентов. Это привело к тому, что до настоящего времени нет однозначного объяснения причины серологической резистентности и различий в сроках негативации у больных, получивших однотипное лечение; возникают проблемы установления достоверного диагноза врожденного сифилиса; не разработаны критерии определения жизнеспособности возбудителя сифилиса в организме хозяина. Вероятно, ответы на эти и другие вопросы могут быть получены при условии идентификации в крови или других биологических жидкостях (например, ликворе) человека самого возбудителя или каких-либо его специфических компонентов (маркеров). После открытия в середине 80-х годов XX века принципа ПЦР появилась реальная возможность прямой детекции возбудителей инфекционных заболеваний (K.Mullis, A.Falona, 1987; L.Stamm и соавт., 1991; В.И.Киселев и соавт., 2000). Метод основан на правиле комплементарности, т.е. способности цепей ДНК распознавать друг друга с высокой степенью специфичности и на принципе естественной репликации ДНК. Он состоит из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть выявлены обычными методами детекции (Н.А.Федоров и соавт., 1996; С.Н.Щербо, В.Б.Макаров, 1998). Тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другие лабораторные методологии (иммунологические, бактериологические, микроскопические) невозможны. Это достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-системы, которая позволяет выявлять даже единичные клетки возбудителей, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов колеблется в пределах 103-106 клеток (А.Л.Гинцбург, 1998). Поскольку в используемом материале выявляется характерный лишь для данного возбудителя фрагмент ДНК, задаваемый нуклеотидной последовательностью праймеров, ПЦР-диагностикумы в отличие от иммунологических тест-систем исключают проблемы, связанные с перекрестно реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность (И.Г.Дубинина, 1996; А.В.Мошкалов и соавт.; В.И.Киселев и соавт., 2000; Г.А.Дмитриев и соавт., 2002). Недостаточная информативность серологических реакций обусловливает разработку вариантов ПЦР для диагностики сифилиса. Однако все проводимые исследования в области его ДНК-диагностики носят экспериментальный характер (С.Г.Лыкова, Д.А.Шахматов, 1998; Г.А.Дмитриев и соавт., 2002). Существует значительное число работ, авторы которых сравнивают результаты ПЦР- анализа с другими серологическими исследованиями, а также темнопольной микроскопией, иммунофлюоресценцией различных биологических жидкостей (крови, ликвора) и соскобов при тех или иных формах и стадиях сифилиса (И.И.Петухова, 2001). Вместе с тем следует подчеркнуть, что ПЦР-анализ, довольно широко распространенный для диагностики многих инфекционных заболеваний, в том числе ИППП, для диагностики сифилиса не регламентирован органами здравоохранения и во всем мире имеет пока исследовательский статус. Гонорея Лабораторная диагностика гонококковой инфекции осуществляется как для установления диагноза гонорея, так и с целью утверждения критерия излеченности и оценки эффективности терапевтических воздействий. Все методы, применяемые в настоящее время для детекции N. gonorrhoeae, подразделяются на следующие: микроскопия (бактериоскопия) мазков, окрашенных синькой и по Граму; бактериология - культуральный метод, подтверждающий "золотой стандарт", а также с помощью молекулярно-биологического анализа (ПЦР). Серологические исследования гонококковой инфекции - реакция Борде-Жангу (аналог РСК) представляют в настоящее время исторический интерес и в практике не используются. Как правило, при острой форме гонореи, особенно мужчин, для обнаружения гонококков достаточно использования бактериоскопии. Установление типичных колоний гонококков, а также использование оксидазного реактива и исследование сахаролитических свойств N. gonorrhoeae осуществляется с помощью соответствующих отечественных (Т.Г.Коликова) или зарубежных (Rapid NH System, USA и др.) тестов дает возможность установления диагноза. Вместе с тем при хроническом инфекционном процессе, обследовании женщин и детей и в ряде других случаев необходимо получение бактериологических данных. С этой целью используется методология посева отделяемого (соскоба) мочеполовых органов на питательные среды. Специфичность и чувствительность бактериологического метода при точном соответствии рекомендациям и наличии квалифицированного персонала достигает 90- 99%. При невозможности однозначного установления диагноза клиницисты прибегают к так называемому методу биологической провокации со стандартной гоновакциной - 500 млн м.т. производства "Биолек" (Харьков, Украина) с последующей 3-кратной бактериоскопией. Проведение рандомизированного контролируемого исследования (РКИ) (Е.Н.Филатова, В.А.Аковбян, Г.А.Дмитриев, 2000, 2001) не позволило нам установить факт повышения выявляемости гонококка у пациентов, которым вводилась гоновакцина. Не обсуждая проблему физиологичности метода провокаций, возможной токсичности и отдаленных побочных действий, следует отметить болезненность процедуры провокации, значительные организационные трудности и весьма низкую комплаентность провокации, связанную с необходимостью 3-кратного посещения КВД или женской консультации. На наш взгляд, наиболее целесообразным является одновременное взятие материала для исследования мазков и посевов во время первого визита пациента, что дает возможность практически во всех случаях установить наличие гонококка и полностью отвечает критерию цена-качество. ДНК-диагностика, главным образом ПНР-анализ, при гонококковой инфекции не нашла широкого применения в практике дерматовенерологии и других смежных специальностей. Это связано с тем, что тест-системы для детекции гонококка зарубежного производства фактически недоступны из-за их высокой стоимости. Отечественные тест- системы, как правило, невысокого качества и в своем большинстве официально не зарегистрированы и не регламентированы Минздравом РФ. Предварительные исследования показали, что между результатами бактериологического исследования и данными ПЦР-анализа имеются определенные расхождения. Научно-прикладные исследования в этом направлении продолжаются. Важным моментом в комплексной диагностике гонореи, как и других ИППП, является установление чувствительности гонококка к наиболее широко используемым в клинике антибиотикам: тетрациклинам, макролидам, цефалоспоринам, фторхинолонам и др. В настоящее время наиболее доступным и неплохо зарекомендовавшим себя методом является метод дисков, при котором по степени "задержки" роста определяется чувствительность микроба к антибактериальному препарату. Начаты исследования для определения чувствительности гонококка и других микроорганизмов методом ДНК-диагностики. Трихомониаз Трихомониаз - единственная инфекция, передаваемая почти исключительно половым путем, возбудителем которой не являются ни бактерии, ни вирусы. Возбудитель трихомониаза - Trichomonas vaginalis принадлежит к семейству простейших (protozoa). Трихомониаз является одной из самых распространенных ИППП (более 300 случаев на 100 000 населения России ежегодно). Лабораторные подходы базируются главным образом на микроскопии и культуральной диагностике. Наиболее распространены в практике исследования нативных препаратов, а также мазков, окрашенных по Граму, в которых одновременно можно исследовать гонококк и трихомонаду, а также микрофлору и мицелий грибов. Темнопольная микроскопия препаратов с целью детекции Т. vaginalis, на наш взгляд, незаслуженно забыта, хотя в ряде случаев превосходит другие микроскопические методы диагностики. Культуральные исследования, являющиеся подтверждающим тестом, в России проводятся довольно редко, что связано с фактическим отсутствием стандартизованных отечественных питательных сред. ИФА, зарекомендовавший себя как один из ведущих методов в лабораторной диагностике сифилиса и других инфекционных заболевании, при трихомониазе в настоящее время имеет статус исследовательского: проводятся широкомасштабные клинико-лабораторные испытания в сравнительном аспекте с целью установления его диагностической ценности и разработки показаний к его применению (Г.А.Дмитриев, Н.И.Сюч, 2002). Разрабатываются тест-системы ПЦР для лабораторной диагностики трихомониаза. Предварительными исследованиями установлена их высокая чувствительность и специфичность (до 99%). Однако в настоящее время устанавливать диагноз с помощью одного ПЦР-анализа не представляется возможным и он служит лишь в качестве информационного дополнительного теста. Комплекс микроскопических и культуральных исследований при наличии надежных питательных сред, опытного персонала позволяет в подавляющем большинстве случаев адекватно диагностировать трихомониаз и оценивать эффективность проводимой терапии. Диагностическая ценность ИФА и ПЦР будет установлена в ближайшее время, что, видимо, позволит разработать новый комплексный подход к диагностике трихомонадной инфекции. Хламидиоз Хламидиоз урогенитального тракта - одна из распространенных ИППП, вызванная Chlamydia trachomatis. Эта инфекция поражает мужчин, женщин и детей, регистрируется у новорожденных, оказывает негативное влияние на репродуктивное здоровье и часто является причиной бесплодия (Г.А.Дмитриев и соавт., 1999; В.А.Аковбян и Г.А.Дмитриев, 2000). Хламидии - грамотрицательные бактерии с облигатным внутриклеточным энергозависимым паразитизмом и уникальным циклом развития, представляющим чередование элементарных и ретикулярных телец (форм), т.е. имеет место некий диморфизм, а с учетом относительно недавно выявленных промежуточных (переходных) форм - полиморфизм. В последнее время (Эдельштейн, 1999) в таксономии хламидий произошли изменения и семействоChlamydiaceae, ранее содержащее 1 род Chlamydia, было разделено на два: Chlamydia и Chlamydophila, к которому и была отнесена С. trachomatis. Хламидии, вызывающие негонококковые уретриты, цервициты, сальпингиты, проктиты, простатиты, эпидидимиты и другие заболевания, принадлежит к сероварам D, Е, F, G, Н, К, иногда В. Слово "хламидия" означает мантия, которую наблюдали вокруг этого объекта Гальберштедтер и Провачек, а "трахоматис" связано с тем, что впервые этот микроб был обнаружен в клетках слизистой оболочки глаза у больных трахомой и первоначально ошибочно принят за ее возбудитель. Относительно хорошо изучена антигенная структура этой бактерии и выделены три основных антигенных комплекса: родоспецифический, видоспецифический и сероварспецифический. Высказываются мнения (Г.А.Дмитриев и соавт., 1999; Е.Е.Брагина и соавт., 2002) о возможности существования латентных или персистирующих форм хламидий, как при моделировании in vitro, так и в организме больного. Появление этих форм является своеобразным биологическим феноменом в результате нарушений различных фаз жизненного цикла хламидий. С. trachomatis в силу размера, отсутствия роста на питательных средах (был период, когда ее относили к вирусам), полиморфизма, уникального жизненного цикла, существования персистентных форм, а также отсутствия патогномоничной симптоматики и частого сочетания с другими ИППП представляет собой серьезные трудности при диагностике, и диагноз хламидиоза, безусловно, должен устанавливаться с помощью лабораторных методов исследования. Тестовые процедуры при диагностике хламидийной инфекции мало отличаются от других бактериальных ИППП и включают: прямую визуализацию патологического агента в клинических образцах (бактериоскопический метод); выявление специфических антигенов в биологических образцах от пациентов; изоляцию агента из тканей больного (культуральный метод); определение специфических хламидийных генов или их маркеров в клинических образцах; иммунохроматографический (быстрый) тест. Бактериоскопический метод заключается в изучении мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе или другими красителями с целью обнаружения цитоплазматических включений хламидий. Материалом исследования служат главным образом соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шейки матки. Чувствительность этого метода крайне низка и при диагностике урогенитального хламидиоза им не пользуются. Наиболее распространенным методом диагностики является иммунофлюоресценция прямая (ПИФ) или непрямая (НПИФ), регламентированная приказом Минздрава РФ №286 от 1993 г. и подробно описанная в многочисленных пособиях и публикациях. Метод прост, доступен, обладает весьма высокой специфичностью, в то же время чувствительность его варьирует в пределах 70%. Метод ИФА для выявления антительного ответа (иммуноглобулины классов G, М, А) пока не имеет широкого применения, так как дает большое количество ложноположительных результатов и нуждается в применении подтверждающих или дополнительных тестов. Необходимы широкомасштабные исследования, демонстрирующие корреляцию титра антительного ответа с клиническими проявлениями хламидийной инфекции. Принимая во внимание низкую "иммуногенность" штаммов хламидий и возможность присутствия антител после перенесенной инфекции целесообразно исследовать несколько проб сыворотки в динамике заболевания с интервалом 2-3 нед. Поскольку хламидии не размножаются на искусственных питательных средах, бактериологический (культуральный) метод диагностики основан на их выделении путем заражения первичных или перевиваемых клеточных культур. В процессе культивирования производят идентификацию возбудителя и определение чувствительности к антибиотикам (О.Е.Орлова, Г.А.Дмитриев, С.Ю.Сидорович). Методы амплификации нуклеиновых кислот применяются при диагностике ИППП относительно недавно, но уже зарекомендовали себя как перспективные, особенно в случаях критичности микробов к условиям культивирования, а также при заборе материала с помощью неинвазивных методов. Описаны и используются различные методы диагностики хламидиоза с помощью ПЦР- анализа, имеются сертифицированные отечественные и зарубежные тест-системы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью. Получены данные, свидетельствующие о возможности использования ПЦР-анализа и в качестве критерия излеченности (М.Ф.Латыпова, 2001). Ранее с этой целью использовалась лишь культура клеток. Достоверная диагностика хламидиоза должна базироваться не менее чем на двух методиках, выполненных параллельно: ПИФ (НПИФ) с культурой клеток или ПЦР- анализом; ИФА в настоящее время является дополнительным, информативным методом исследования. В заключение следует отметить, что даже короткий "экскурс" в лабораторную диагностику некоторых наиболее распространенных ИППП свидетельствует о многочисленности и разноплановости методических подходов, с одной стороны, и определенных трудностях при установлении диагноза, изучении динамики патологического инфекционного процесса, прогноза заболевания и критерия излеченности - с другой. Лишь совокупность клинических и лабораторных мероприятий, использование научно обоснованных, регламентированных методов, сертифицированных, регулярно контролируемых тест-систем, диагностикумов, питательных сред, четкое соблюдение персоналом рекомендаций по постановке реакций и интерпретации полученных результатов дадут возможность проведения качественной и адекватной диагностики этих заболеваний.

About the authors

G. A Dmitriev

References

Supplementary files