Sostoyanie laboratornoy diagnostiki sifilisa v Rossii

Abstract

Научно-технический прогресс в области диагностики различных заболеваний не обошел и инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в том числе одну из наиболее социально опасных - сифилис. Социальная значимость или опасность сифилитической инфекции, которая формулируется как "угроза здоровью нации", обусловливает особую ответственность врача-лаборанта при постановке диагноза.

Full Text

Научно-технический прогресс в области диагностики различных заболеваний не обошел и инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в том числе одну из наиболее социально опасных - сифилис. До начала 2001 г. основополагающим документом, регламентирующим постановку лабораторного диагноза "сифилис", являлся Приказ МЗ СССР №1161 (1985 г.). Необходимо отметить, что на тот период времени этот комплекс серологических реакций был достаточно обоснован как научными исследованиями, так и данными клинической практики. Антигены и ингредиенты, используемые в реакциях, проходили как внутренний (на производстве), так и внешний (экспертные лаборатории) контроль качества. Вместе с тем эти методологии были низко технологичными, не всегда позволяли проводить количественную оценку результатов, занимали большие объемы времени, обладали недостаточной чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, не исключали субъективизм при оценке результатов, требовали наличия патогенной бледной трепонемы (РИФ и РИТ), что в свою очередь предполагало наличие вивария и в итоге значительно усложняло и удорожало постановку диагноза. Многочисленные научные, в том числе и диссертационные исследования, направленные на повышение качества этих методологий (70- 80-е годы), не смогли коренным образом оптимизировать лабораторную диагностику сифилиса. Социальная значимость или опасность сифилитической инфекции, которая формулируется как "угроза здоровью нации", обусловливает особую ответственность врача-лаборанта при постановке диагноза. На протяжении многих лет в России использовался комплекс серореакций, где одна реакция как бы подтверждает и дополняет другую, что в целом должно было уменьшить вероятность ошибок и способствовать установлению истинного диагноза. Подобный принцип используется для установления лабораторного (этиологического) диагноза и других инфекционных заболеваний: гонореи, трихомониаза, хламидиоза. Таблица 1. Методы лабораторной диагностики сифилиса Название реакции Используемые реактивы Предназначение Модификации реакции Примечание Реакция микропреци-питации (РМП) Кардиолипиновый антиген Отборочный(скрининговый) тест RPR, VDRL, TRUST Быстрый простой тест Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) Трепонемный антигенкультуральный или пато- генный (набор) Специфический тест:подтверждающий илиотборочный РПГА с культуральнымили патогеннымантигеном; эритроцитыптичьи или бараньи Высокочувствительныйбыстрый и простой тест, не требует приборногообеспечения Иммуноферментный анализ (ИФА) Культуральныйтрепонемный антиген(набор) Специфический тест:подтверждающий иотборочный Выявление иммуногло-булинов класса G, M и суммарных Высокочувствительныйбыстрый и простой тест, требует приборногообеспечения Комплекс серореакций: реакции связываниякомплемента (РСК) и реакция микропреци-питации (РМП) Трепонемный ультраозву-ченный и кардиолипиновыйантигены Диагностический тест Недостаточно чувствительный и специфический тест;большие затраты ручного труда Реакция иммуно-флюоресценции (РИФ) Трепонемный антиген (штамм Никольс) Специфический,подтверждающий тест РИФ-абс, РИФ-200, РИФ-ц. Высокочувствительный,технически сложный и субъективный тест Реакция иммобилизациибледных трепонем(РИБТ) Трепонемный антиген(штамм Никольс) Меланжерный метод Высокочувствительный тест, технически сложный и субъективный Таблица 2. Подходы к лабораторной диагностике сифилиса: прошлое, настоящее, будущее Серологическая диагностика сифилиса Приказ №1161 (1985 г.) Приказ №87 (2001-2006 гг.) После 2006 г. (?) КСР: РСК (реакции Вассермана) с кардиолипиновым и трепо-немным антигенами + РМП - отбо- рочные и диагностические реакции РМП/RPR и их аналоги - отборочная реакция,качественный и количественный вариантыРИФ, РИБТ - диагностические реакции ИФА, РПГА - отборочные и диагностическиереакции, в том числе для ликвородиагностики РИФ, РИБТ - диагностические реакции РМП/RPR и их аналоги - отборочная реакция,качественный и количественный вариантыИФА, РПГА - отборочные и диагностические реакции, в том числе для ликвородиагностики РСК (Вассермана) - диагностическая реакция РИФ, РИБТ - диагностические реакции по показаниям только! В лабораторной диагностике сифилиса применялись отборочные (скрининговые), нетрепонемные тесты: реакция преципитации (РМП) и ее модификации и диагностические (специфические), подтверждающие (РСК с двумя антигенами, РИФ и ее модификации, а также РИТ). Все указанные диагностические тесты, за исключением темнопольной микроскопии, которая может применяться лишь при манифестных клинических проявлениях сифилиса, являются непрямыми, т.е. при их постановке учитывается антительный ответ на внедрение в организм человека T.pallidum - появление в крови, спинномозговой и лимфатической жидкостях различных антител: преципитинов, агглютининов и др. Таким образом, алгоритм обследования пациентов с подозрением на сифилитическую инфекцию заключался в использовании КСР (РМП и РСК), а при необходимости и по отдельным показаниям - в постановке РИФ и реже РИТ. Однако уже в 70-х годах была показана возможность применения иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА, TPHA) в диагностике сифилиса (J.Veldkamp, A.Visset, 1975; T.Tomizava, S.Kasamatsu, 1966; T.Tomizava и соавт., 1969), что в дальнейшем послужило основанием к созданию технологического производства коммерческих диагностических тест-систем. За рубежом такие методологии при диагностике сифилиса с успехом применяются на протяжении многих лет и являются ведущими при установлении диагноза "сифилис", а также других инфекционных заболеваний. Принцип ИФА заключается в соединении комплекса антиген-антитело с конъюгатом, содержащим ферментную метку, выявляемую с помощью субстратной смеси. В настоящее время ИФА-тест-системы разрабатываются в основном по трем схемам проведения реакции. Первая схема осуществляется в III фазы: на твердофазном носителе зафиксирован антиген возбудителя (T. pallidum), который инкубируется с испытуемой сывороткой, реже - плазмой крови, и при наличии в них противотрепонемных антител происходит связывание с образованием комплекса антиген-антитело. В качестве объекта исследования может служить капиллярная кровь из пальца, что облегчает обследование детей и лиц пожилого возраста. После удаления несвязавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгат) и на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам антиген-антитело, меченных ферментом (II фаза). После удаления не связавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодействие его с ферментом и отмечается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител (III фаза). Результат оценивается спектрофотометрически, что исключает субъективность оценки, или визуально. По такому принципу осуществляется постановка большинства реакций ИФА для диагностики сифилиса. Вторая схема - ИФА с фиксированными антителами или "ловушка для антител": на твердофазном носителе фиксируются аффинно очищенные антитела против определенного класса иммуноглобулинов, которые связывают находящиеся в испытуемых сыворотках крови иммуноглобулины соответствующего класса (I фаза); образование комплекса антитело-специфический иммуноглобулин выявляют с помощью конъюгата, состоящего из антигенов бледной трепонемы, меченных ферментом (II фаза). При инкубации с субстратом (III фаза) в случае наличия сифилитических антител в испытуемой сыворотке или плазме крови наступает окрашивание раствора. По этой схеме разрабатываются тест-системы для выявления противотрепонемных IgM. Третья схема ИФА используется для выявления суммарных антител, специфических для определенного антигена, независимого от их класса. Принцип ее заключается в том, что специфические сывороточные антитела одновременно взаимодействуют с антигеном, зафиксированным на твердофазном носителе, и с тем же антигеном, меченным ферментом при совместной инкубации сыворотки крови и конъюгата (I фаза), а наличие образовавшегося комплекса определяют с помощью субстрата (II фаза). В зависимости от используемых антигенов все ИФА-тест-системы для выявления антител подразделяются на: лизатные, рекомбинантные и пептидные. Последние две в связи с их высоким качеством используются в настоящее время в России и за рубежом. Следует отметить, что ИФА, как и другие реакции на сифилис, могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Первые могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой IgM против собственных IgG человека, за счет перекрестно-реагирующих с трепонемными антигенами антител, образующихся при различных системных заболеваниях или индуцированных лекарственными препаратами, наркотиками, нарушениями обмена; у новорожденных - путем образования в организме плода или ребенка IgM-антител к IgG матери, что значительно осложняет интерпретацию результатов и установление диагноза врожденного сифилиса (Н.В.Фриго, 2001-2002; Г.А.Дмитриев, Н.В.Фриго, 2004). Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены наряду с техническими ошибками конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, поскольку последние обладают большим аффинитетом. К наиболее типичным техническим ошибкам при постановке ИФА, приводящим к получению недостоверных результатов, следует отнести неточное разведение ингредиентов, нарушение температурного режима, времени инкубации реагентов, сроков нанесения их на планшет, несоответствие рН растворов требуемым нормативам, неправильная техника промывки, загрязнение лабораторной посуды. Также при постановке ИФА следует придерживаться следующих правил: не использовать для исследования хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки; применять стандартные условия взятия и хранения образцов, не практиковать 2-кратное и более замораживание - оттаивания образцов сыворотки крови, и соблюдать другие условия (Г.А.Дмитриев и соавт., 1997; В.К.Ткачев, 1997; А.В.Масяго, 2003). В настоящее время ИФА приспособлен для исследования ликвора, что важно для диагностики поздних форм сифилиса, так как ни одна из тест-систем отечественного и зарубежного производства не имела соответствующих показаний, а РИФ-ц - высокочувствительный и специфический тест - ограничена техническими сложностями (Г.А.Киселева и соавт., 1999). В настоящее время методика ликвородиагностики поздних форм заболевания и нейросифилиса с помощью ИФА наряду с РИФЦ и РСК применяется в практике лабораторий, представлена в Приказе МЗ РФ №87 (2001 г.) и обладает рядом преимуществ: относительной простотой, объективизмом получения результатов, более высокой воспроизводимостью, дешевизной. Для характеристики концентрации противотрепонемных антител определяется значение коэффициента позитивности (КП), который в свою очередь рассчитывается по отношению оптической плотности (ОП) исследуемого образца к ОП критической: КП=ОП образца/ОП критической. (Г.А.Дмитриев и соавт., 1997; В.К.Ткачев, 1997). Имеются и другие варианты подсчета концентрации антител (Н.В.Фриго, 1999-2000; Г.А.Дмитриев, Н.В.Фриго, 2004), что весьма важно для количественной оценки антительного ответа в биологических жидкостях человека, позволяет судить об активности инфекционного процесса, а также в определенной мере о качестве используемых тест-систем для ИФА. Наряду с широким использованием тест-систем для ИФА, продолжаются исследования рекомбинантных антигенов T. pallidum с целью повышения чувствительности и специфичности. На основе полученных рекомбинантных белков и сравнительного анализа их диагностической ценности в качестве иммуносорбента были созданы более чувствительные и специфичные тест-системы для ИФА на сифилис. Таким образом, ИФА, практически не уступающий по основным лабораторным параметрам ранее используемым методам диагностики сифилиса и обладающий несомненными преимуществами: быстротой, объективностью за счет автоматизации учета результатов, возможностью исследования иммуноглобулинов различных классов, что важно для ранней диагностики сифилиса, врожденного сифилиса, прогноза заболевания и удобством в работе, - в настоящее время является одной из основных методологий, используемых при лабораторной диагностике сифилиса (Приказ №87 МЗ РФ, 2001 г.) в качестве скринингового (отборочного) и подтверждающего (диагностического) тестов. ИФА может использоваться в различных медицинских учреждениях, в том числе в службе переливания крови. Еще одним весьма перспективным методом диагностики сифилиса, регламентированным этим же приказом, является реакция пассивной гемагглютинации, применяемая для выявления специфических антител к T. pallidum в сыворотке крови: при соединении антигенов бледной трепонемы со специфическими антителами в реакции на микропланшете наблюдается феномен агглютинации эритроцитов. Уже в 70-80-х годах была продемонстрирована высокая чувствительность реакции (на уровне РИФ) и специфичность (на уровне РИТ), а по простоте и доступности ей нет равных (A.Luger, 1980). РПГА продемонстрировала преимущество при установлении ложноположительных результатов, может с успехом применяться при установлении сифилиса у доноров, как ИФА, а также при поздних формах сифилиса и леченых больных. Вместе с тем следует отметить, что РПГА, как и любой другой специфический тест, не может быть использован в качестве критерия излеченности заболевания, так как негативация таких реакций, как правило, затруднена, более того, они могут оставаться положительными в течение всей жизни. Вместе с тем по снижению их титра можно в определенной степени судить об эффективности проводимого лечения. Сторонники реакции связывания комплемента (реакции Вассермана) аргументируют необходимость сохранение старых методологий более быстрой негативацией этой серореакции после адекватной терапии. Это отчасти верно: первой негативация отмечается, как правило, в РСК с кардиолипиновым антигеном, а затем - с трепонемным. Однако эти возражения отметаются при использовании алгоритма обследования и ведения пациентов, заключающегося в использовании микрореакции (РМП), в том числе с капиллярной кровью, и РПГА или ИФА при установлении диагноза. В дальнейшем, в течение года после лечения по снижению титра РМП (RPR) в 4 (2 разведения) раза и более можно судить об эффективности терапии. Учитывая более высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость РПГА и ИФА, такая комплексная методология имеет значительные преимущества по сравнению с теми, которые содержались в отмененном Приказе МЗ СССР №1161. РПГА является весьма ценным диагностическим тестом на всех стадиях сифилиса, при его использовании отсутствует надобность в живой патогенной бледной трепонеме; тест является бесприборным (хотя существует возможность автоматизации реакции), однозначно интерпретируется и не представляет сложности даже при невысокой квалификации врача-лаборанта. Следует отметить, что ингредиенты, используемые в различных тест-системах для РПГА или ее модификаций (TPHA), микро-РПГА (MH-TPHA), отличаются антигеном: штамм Рейтер или Никольс и эритроцитами (бараньи, птичьи). Многочисленные исследования продемонстрировали практически полную идентичность результатов независимо от используемого антигена и более быстрое получение результатов при наличии в наборе птичьих эритроцитов. Таким образом, в настоящее время регламентированными в дополнении к "старым" являются ИФА и РПГА (Приказ МЗ РФ №87), которые к 2006 г. должны превалировать при лабораторных исследованиях сифилиса (табл. 1). К этому следует добавить необходимость более широкого использования микрореакции (РМП, RPR и др.) как в качественном, так и в количественном вариантах, причем в ряде случаев (дети, пожилые пациенты и др.) ее целесообразно проводить, используя кровь, взятую из пальца. Таким образом, создан новый комплекс исследований: РПГА или ИФА с микрореакцией (RPR), - который можно применять практически при всех формах сифилиса. В России и за рубежом на базе таких реакций созданы различные варианты методологий, позволяющие в подавляющем большинстве случаев осуществлять достоверную диагностику сифилиса, а также в определенной мере судить об эффективности лекарственной терапии и динамике инфекционного процесса. Справедливости ради следует отметить, что незначительная часть специалистов, несмотря на очевидные преимущества РПГА и ИФА, до сих пор является “приверженцами” реакции Вассермана, аргументируя это более низкой стоимостью обследований. Однако стоимостные соображения, думается, не играют решающей роли для установления диагноза такого заболевания, как сифилис, тем более что широкое применение этих методологий несомненно снизит цену диагностических наборов. Кроме того, они не учитывают субъективизм, низкую технологичность, длительность постановки РСК, РИФ, РИТ, невозможность их стандартизации и множество других факторов, не позволяющих производить адекватную диагностику сифилиса. Неотъемлемой составляющей получения достоверных результатов лабораторного анализа, наряду с качеством тест-систем, ингредиентов, оборудования, выполнением инструкций, квалификацией персонала и другими факторами, является наличие в лаборатории контрольных образцов - сывороток крови пациентов, "оттитрованных" различными методами исследования. Дело в том, что к одной из эндогенных причин получения неадекватных результатов, как ложноположительных, так и отрицательных, относят физико-химические изменения сыворотки крови, являющиеся следствием появления в биологической жидкости кризисных липидно-протеиновых комплексов и повышения дисперсности коллоидов, что в свою очередь обусловливает возможный механизм неспецифичности серологических реакций. В России для оценки качества тест-систем и работы лабораторий, производящих диагностику сифилиса, созданы лиофильно высушенные биопробы (сыворотки крови) в виде ампулированных панелей ("Вектор-Бест" и "МБС"), к которым прилагаются инструкция и паспорт, удостоверяющий наличие (отсутствие) антительного ответа, априори установленного комплексом клинико-лабораторных методологий и выполненного в независимых экспертных лабораториях. В настоящее время в рамках Федеральной системы внешней оценки контроля качества диагностических лабораторий (ФСВОКК) панели сывороток крови с соответствующей документацией высылаются в лаборатории и, несомненно, способствуют оптимизации процесса постановки диагноза, в частности, при исследовании "сомнительных" жидкостей, разночтении результатов различных реакций. Использование таких панелей в качестве контрольных проб чрезвычайно важно в настоящем "переходном" периоде, когда применяется несколько различных методологий: КСР, РИФ, ИФА, РПГА, РИТ, а также будет способствовать накоплению собственного опыта работы с относительно новыми методологиями и их модификациями. Наряду с техническими ошибками, неверной интерпретацией серореакций, несовершенством диагностикумов одной из проблем лабораторной диагностики сифилиса является получение так называемых ложноположительных реакций у значительного контингента пациентов, страдающих сердечно-сосудистыми, легочными, системными, хроническими инфекционными и другими заболеваниями, а также у лиц пожилого возраста. Таким образом, проблема дифференциального клинико-лабораторного диагноза весьма актуальна и лежит в основе терапии скрытого сифилиса и ложноположительных реакций (Г.А.Дмитриев, Н.В.Фриго, 2004). Объяснение этого феномена требует дополнительных научно-прикладных исследований, включающих изучение иммунного статуса, и является предметом отдельных публикаций. В последние годы получены сведения (Э.Г.Ким, 1992; А.В.Резайкина, Г.А.Аковбян, А.Э.Ким, 1999-2000; Н.В.Фриго, 1999-2003; П.Г.Богуш и соавт., 2003, и др.) о специфичности нарушений показателей клеточного иммунитета и факторов естественной резистентности микроорганизма при сифилитической инфекции и отмечены их особенности в зависимости от стадии заболевания. Не исключено, что иммунные реакции в перспективе могут быть включены в комплекс клинико-лабораторного обследования пациентов с подозрением на сифилис. Одна из основных и пока непреодолимых проблем лабораторной диагностики сифилиса заключается в невозможности в настоящее время детектировать наличие (отсутствие) самого возбудителя - T. pallidum, поскольку все используемые методы, за исключением "темнопольной микроскопии" и заражения сифилисом кроликов (RIT), являются непрямыми и учитывают только антительный ответ. Создание надежного метода, "улавливающего" антиген (ДНК или РНК), несомненно, оптимизирует диагностику раннего, врожденного, скрытого сифилиса, поздних его форм, значительно облегчит изучение динамики инфекционного процесса и эффективности терапии. Справедливости ради необходимо отметить, что и у нас, и за рубежом существует ряд пилотных наборов и научных разработок (М.И.Артемьев и соавт., 2000; Н.А.Федоров и соавт., 2001; И.И.Петухова, 2002; А.Е.Гущин 2001, 2003; M.Sutton и соавт., 2001, и др.), использующих метод амплификации нуклеиновых кислот для детекции ДНК T.pallidum в материале от пациентов. Получены обнадеживающие результаты применения ПЦР-анализа для детекции T. pallidum в различных биологических жидкостях человека: сыворотке, плазме крови, ликворе, пунктате лимфатических узлов, а также при различных формах сифилиса - первичном, вторичном и раннем скрытом сифилисе (А.Е.Гущин, 2003; М.В.Зорькина, Н.Ю.Воронова, 2003). Получены предварительные результаты, свидетельствующие о более высокой эффективности ПЦР-анализа по сравнению с "темнопольной" микроскопией и перспективности исследования различных вариантов ДНК-диагностики сифилиса. Таким образом, в России за последние несколько лет произошли серьезные изменения в лабораторной диагностике сифилиса - системного, хронического и социально опасного заболевания. Получен значительный опыт работы с РПГА и ИФА, а также вариантами РМП (RPR и др.), которые регламентированы для диагностики всех форм сифилиса (табл. 2). Все это позволяет придти к следующим выводам: разработан алгоритм первичного обследования пациентов, а также изучения динамики инфекционного процесса и эффективности противосифилитической терапии; получены данные о специфичности изменений показателей клеточного иммунитета и факторов естественной резистентности макроорганизма при сифилисе, что, вероятно, может служить дополнительным диагностическим признаком заболевания, а также будет способствовать иммунокоррекции в ходе терапии; активно разрабатываются тест-системы, позволяющие установить наличие антигена T. pallidum в биологических жидкостях организма пациента на базе ПЦР-анализа, что, несомненно, оптимизирует установление диагноза и объяснит наличие антительного ответа и ложноположительных реакций; созданы лиофильно высушенные панели сывороток, применяемые для контроля качества выпускаемых в России и за рубежом тест-систем, а также для лабораторных (сравнительных) исследований на сифилис. Автор приносит искреннюю благодарность сотрудникам ФСВОК - проф. В.Н.Малахову и И.Л.Хайдуковой за предоставленные материалы.