Rol' bioplenok v patogeneze tyazhelykh infektsionnykh oslozhneniy i sovremennye vozmozhnosti terapii

Full Text

Внутрибольничные инфекционные осложнения являются на сегодняшний день одной из важнейших проблем здравоохранения и клинической медицины. Они не только приводят к ощутимым экономическим потерям, но и наносят ущерб репутации здравоохранения в целом и, что важнее всего, ежегодно уносят тысячи людских жизней (например, в странах Европейского союза – около 25 тыс. летальных исходов в год). Наиболее тяжелыми, прогностически неблагоприятными группами инфекций, развившихся в стационаре, являются так называемые катетерассоциированные инфекции кровотока, вентиляторассоциированные пневмонии (ВАП) и сепсис. В этиологии этих осложнений значительная доля принадлежит золотистому стафилококку и грамотрицательным бактериям, таким как Pseudomonas aeruginosa. Один из ключевых моментов патогенеза данных заболеваний – формирование этими микроорганизмами биопленок на катетерах и эндотрахеальных трубках, позволяющее существенно повысить их вирулентность, защитить бактериальные клетки от действия как собственных защитных сил организма человека, так и антибактериальных препаратов (АБП). В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, способных разрушать биопленки или препятствовать их образованию. Первые сообщения о роли бактериальных биопленок при разных инфекциях появились около 25 лет назад. На сегодняшний день биопленки описаны для 65% возбудителей инфекционных заболеваний, изучены многие процессы формирования и жизнедеятельности биопленок. Бактериальные биопленки – это высокоупорядоченные сообщества бактерий, формирующиеся на биологических или искусственных поверхностях в результате адгезии, роста и размножения микроорганизмов и образования полисахаридного внеклеточного матрикса. Бактерии в составе биопленок отличаются значительно более высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, в том числе антимикробных препаратов. В процессе своего существования бактериальные биопленки способны периодически высвобождать планктонные формы бактерий, что может служить источником поддержания хронического инфекционного и воспалительного процесса. Формирование биопленки Адгезия Первый этап формирования биопленки – адгезия. Адгезия микроорганизмов возможна как к биологическим поверхностям (к клеткам тканей, стенкам сосудов), так и к таким медицинским материалам, как латекс, силикон, поливинилхлорид, в меньшей степени –тефлон, полиуретан, нержавеющая сталь и титан. Изначальное прикрепление микробной клетки к поверхности субстрата осуществляется за счет действия электростатических, гидрофобных сил, связей Ван-дер-Ваальса и неспецифической адгезии. Адгезия к биологическим поверхностям обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартмента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток [1]. Для стафилококков важным фактором адгезии является полисахаридный межклеточный адгезин (Polysaccharide Intercellular Adhesin – PIA). PIA инициирует гемагглютинацию и препятствует фагоцитозу за счет активации бактериальной агрегации. Еще один фактор адгезии стафилококков – это a-токсин стафилококков. Этот токсин способен образовывать поровые каналы в мембранах клеток эукариот, будучи одним из факторов вирулентности стафилококков, но также он обладает свойствами адгезина. Экспериментально показано, что мутанты с нарушенным биогенезом a-токсина и/или PIA не способны формировать полноценные биопленки. Другие факторы формирования биопленок стафилококков включают BAP-белки (biofilmas sociated protein), тейхоевые кислоты и n-ацетилглюкозамин [2]. У грамотрицательных организмов важная роль в адгезии принадлежит жгутикам и фимбриям 4-го типа. Движение, осуществляемое с помощью жгутиков, позволяет образовать клеточный монослой на субстрате, а фимбрии 4-го типа способствуют клеточной агрегации. Выявлено, что в начальные фазы образования биопленок у P. aeruginosa активируются гены, ответственные за биосинтез фимбрий, и экспрессируется ген, кодирующий белок пилин, являющийся структурной единицей фимбрий. Как и у стафилококков, в опытах с P. aeruginosa было показано, что мутантные штаммы по генам, участвующим в биогенезе жгутиков и фимбрий 4-го типа, не способны в полной мере формировать биопленки [3]. Клеточная пролиферация и синтез экзополимерного матрикса После необратимой адгезии популяция микроорганизма начинает интенсивно пролиферировать с образованием многоклеточных слоев. Одновременно с образованием многоклеточных слоев бактерии начинают обильно синтезировать компоненты экзополимерного матрикса. В химическом отношении матрикс неоднороден и различается у разных таксонов. В целом экстрацеллюлярный слой содержит полисахариды: декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу и др. Эта фракция наиболее выражена и составляет порядка 40–95%. Другими компонентами экстрацеллюлярного слоя являются: белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80–90% объема биопленки занимает вода. P. aeruginosa в биопленках обильно синтезирует альгинат, штаммы со сверхэкспрессией гена, кодирующего альгинат, обычно образуют слизистые колонии с выраженными свойствами вирулентности. Альгинат химически связывает аминогликозиды за счет инактивации гидрофильных и положительно заряженных групп в молекуле [1]. Строение и функционирование биопленок В слизистом матриксе бактериальные клетки располагаются не хаотически, а определенным образом. Многоклеточные кластеры имеют вид грибоподобных, столбоподобных образований, укрепленных экзополисахаридным слоем, что позволяет задерживать питательные вещества и поддерживать их концентрацию, а также служит защитой клеток от дегидратации, гуморальных и клеточных факторов резистентности макроорганизма. Кроме того, матрикс в зависимости от его биохимического состава и метаболической активности популяции способен препятствовать диффузии некоторых антибиотиков. Например, аминогликозиды, как отмечалось, достаточно длительно проходят через матрикс, фторхинолоны, напротив, легко проникают через этот барьер. Биопленки не только образуют диффузионный барьер для лекарственных препаратов, но и позволяют бактериям накапливать в матриксе внеклеточные ферменты, разрушающие антибиотики, уменьшать площадь открытой поверхности клеток, что приводит к физической недоступности молекул, и формировать резистентный фенотип клеток. В матриксе имеются каналы, наполненные водой, полости и пустоты. Через каналы транспортируются питательные вещества и проходят потоки кислорода от внешних к внутренним частям биопленки, одновременно с этим выводятся метаболиты бактериальных клеток [4]. Метаболизм и физиологическая активность клеток в составе слоев биопленки также неоднородны. Периферические слои более насыщены кислородом по сравнению с центральными частями, где образуется анаэробная микрониша. Используя микроэлектроды, удалось установить, что на глубине около 30 мкм от поверхности биопленки концентрация кислорода резко снижается [5]. Это приводит к изменению метаболического фенотипа в глубинных слоях биопленки. В частности, у изолятов P. aeruginosa, выделенных от больных муковисцидозом, описан процесс переключения метаболизма с аэробного дыхания на нитратное. При таком переключении конечный акцептор кислорода дыхательной цепи заменяется на молекулы нитратов и нитритов. При этом в клетке происходит регуляторная перестройка экспрессии генов, и начинается синтез специфических для нитратного дыхания ферментов: периплазматической нитратредуктазы, мембранносвязанных нитратредуктаз и др. Ключевая роль в переключении аэробного метаболизма на анаэробный принадлежит регулятору транскрипции Fnr-белку, реагирующему на изменения концентрации молекулярного кислорода. Показано, что анаэробные субпопуляции биопленок синегнойной палочки обладают повышенной устойчивостью к факторам окружающей микросреды и действию антимикробных препаратов [1]. В результате колебаний концентрации кислорода, уровня кислотности параллельно с колебаниями концентраций питательных веществ, метаболитов клеток в биопленках образуются разнородные области. Адаптация к этим микронишам позволяет бактериям формировать множество фенотипов с широкими метаболическими и репликативными свойствами. Такое сообщество (популяция) обладает громадными способностями к сопротивлению стрессовым факторам. Строение биопленок идеально способствует процессам обмена генетической информацией за счет тесного контакта и стабильной пространственной локализации клеток. Исследования in vitro показывают, что уровень конъюгации в биопленках гораздо выше по сравнению с планктонными формами бактерий. Более того, процессы конъюгации могут регулироваться на популяционном уровне за счет бактериальной коммуникации, например, вирулентные энтерококки для передачи генетической информации используют сигнальные системы. Биопленки с дифференцированными клетками бактерий, с гетерогенными микронишами и водными каналами, представляющими примитивную циркуляторную систему, напоминают организацию высших организмов, у которых совокупность дифференцированных тканей образует сложный многоклеточный организм. Сигнальные системы в биопленках В 2007 г. были описаны механизмы межклеточной коммуникации в биопленках (на примере Vibrio fischeri) [6]. Процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток, получил в англоязычной литературе название «Quorum sensing» (QS) – «общий разум». Работу QS можно сравнить с гормональной регуляцией функциональной активности разных органов и тканей в многоклеточном организме. Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы используют разные сигнальные системы и разные химические передатчики сигналов. Первые синтезируют 7–8-членные пептиды (Enterococcus spp.), циклопептиды (Staphylococcus spp.); вторые – разнообразные ацилгомосерин-лактоны (AHL) [1]. На примере синегнойной палочки хорошо изучена система LasI–LasR, в которой в качестве химического сигнала выступают AHL с длинной ацильной цепью. Сигнальная молекула AHL в комплексе с белком LasR образует гомодимер – регулятор транскрипции, который активирует гены, участвующие в формировании вирулентности и патогенности (протеазы, эластаза) и в процессах образования биопленок. Этот же комплекс активирует вторую сигнальную систему RhlI–RhlR, где сигнальной молекулой является N-бутирил-гомосерин-лактон (С4-HSL). Образующийся комплекс С4-HSL-RhlR регулирует транскрипцию генов, кодирующих разные структурные соединения матрикса биопленок (альгината, рамнолипида и др.), а также липазы и пиоцианина. Параллельно двум описанным системам у синегнойной палочки функционирует хинолоновая система: мессенджерами здесь являются гидроксиалкилхинолоны и гидроксигептилхинолоны. Эта система функционирует так же, как и вышеописанные механизмы регуляции, и опосредует увеличение экспрессии факторов вирулентности, в частности, синтез эластазы, лектинов. Кроме того, механизмы QS регулируют процесс переключения фенотипа бактериальной клетки с планктонной формы (свободно передвигающейся) на сессильную («оседлую», находящуюся в биопленке) [1, 7]. AHL являются сигнальной молекулой разных грамотрицательных бактерий: Аcinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Enterobacter, Serratia, Vibrio, Yersinia и др. При этом разные AHL являются в основном специфичными, и коммуникация осуществляется внутри вида. Однако известен также феномен перекрестной коммуникации (cross-talk communication), заключающийся в том, что популяции разных видов способны взаимодействовать в инфекционном очаге. Причем перекрестный QS способен как активировать, так и ингибировать работу зависимых целевых генов в бактериальных ассоциациях. Например, мессенджеры Escherichia coli с длинными ацильными остатками способны ингибировать rhl-сигнальную систему P. aeruginosa. В смешанных биопленках Р. aeruginosa и Burkholderia cepacia буркхолдерии реагируют на сигналы синегнойной палочки, но та, в свою очередь, не чувствительна к сигналам B. cepacia. Следовательно, популяция P. aeruginosa регулирует многие физиологические процессы своего ассоцианта [7]. У грамположительных микроорганизмов QS регулирует процесс переноса плазмид, в результате чего осуществляется траслокация плазмид, несущих гены устойчивости к антибиотикам, гены гемолизинов, бактериоцинов; таким образом проводится бактериальная селекция клеток внутри биопленки [1]. Клетки-персистеры В популяциях биопленок обнаруживается особый субфенотип бактериальных клеток – персистеры (persister’scells). Персистеры – это альтруистические клетки, которые образуются в стационарной фазе роста, они метаболически не активны и обеспечивают выживание материнской популяции в присутствии летальных для всех клеток факторов. В биопленках эта субпопуляция составляет 1–5% от всей клеточной массы. Персистеры обладают свойством антибиотикотолерантности, которую необходимо отличать от антибиотикорезистентности, поскольку здесь речь не идет о предотвращении взаимодействия антибиотика с его мишенью. Толерантность же основывается на способности микробной клетки выживать в присутствии антибиотика за счет замедления метаболизма и «выключения» основных биологических процессов клетки. Антибиотики эффективно проявляют свое действие в отношении интенсивно делящихся клеток с высоким уровнем синтетических процессов. Клетки-персистеры, в свою очередь, находятся в стадии физиологического покоя («клеточного анабиоза»), и антибактериальное средство не способно проявить в полной мере свое действие. Белки персистеров выключают работу всех мишеней антибиотиков, приобретая таким образом мультитолерантность (multi-drugtolerance) [8]. Крайне интересен, но не до конца изучен процесс переключения клеточной физиологии у персистеров. Основная роль здесь принадлежит хромосомным ТА-модулям (toxin-antitoxin). При длительном воздействии стрессовых факторов на бактериальную клетку экспрессируются цитотоксины, которые блокируют трансляцию, репликацию, инициируют программируемую клеточную гибель и «выключают» работу рибосом. Когда клетка вновь оказывается в благоприятных условиях, активируются гены антитоксина, в результате токсин связывается в протеиновый комплекс и метаболические процессы клетки восстанавливаются. Клетки-персистеры, пережившие стресс, связанный с воздействием антибиотика, после прекращения антибиотикотерапии начинают пролиферировать, возобновляется межклеточная коммуникация, и материнская популяция восстанавливается [9]. Краткий обзор современной терапии тяжелых инфекций и сепсиса Современный подход к лечению тяжелых, в том числе внутрибольничных инфекций и сепсиса, подразумевает одновременное эффективное решение ряда разноплановых задач. Сюда относятся неотложные мероприятия по поддержанию гемодинамики и перфузии органов и тканей, своевременный забор биоматериала для микробиологического исследования, адекватная антибактериальная терапия, мероприятия по ликвидации первичного очага инфекции и профилактика ре- и суперинфекции. В дальнейшем продолжается гемодинамическая поддержка с использованием инфузионной терапии, вазопрессоров (норадреналин), в случае необходимости – инотропная поддержка добутамином, введение гидрокортизона. К вспомогательным методам относятся переливание препаратов крови, механическая вентиляция при респираторном дистресс-синдроме, контроль гликемии, профилактика тромбоза глубоких вен, стрессовых язв, адекватное питание [10]. Возможности применения азитромицина при инфекциях, связанных с биопленками В ряде исследований показаны уникальные свойства азитромицина, позволяющие рассматривать его как единственный на сегодняшний день препарат, способный препятствовать образованию биопленки и вызывать уменьшение ее толщины. При исследовании свойств более чем 20 антимикробных препаратов только у азитромицина и в меньшей степени у кларитромицина была отмечена способность в субингибирующих концентрациях нарушать образование биопленки штаммами P. aeruginosa [11]. Вероятно, именно этим объясняется эффективность применения азитромицина у пациентов с муковисцидозом. Кроме того, имеются данные о том, что применение азитромицина в периоперационном периоде при кардиохирургических операциях у детей с врожденными пороками сердца достоверно уменьшает риск развития ВАП (4,5% vs 12,2% в контрольной группе) и нозокомиальных инфекций в целом (9,1% vs 30,9%) [12]. Продемонстрировано, что субингибирующие концентрации азитромицина препятствуют образованию биопленки нетипируемыми штаммами Haemophilus influenzae, а также способствуют уменьшению уже сформированной биопленки [13]. Наблюдаемые эффекты не зависели от чувствительности штамма гемофильной палочки к азитромицину и отмечались как у штаммов, чувствительных к данному антибиотику, так и у резистентных к нему лабораторных мутантов H. influenzae. Имеются сообщения о том, что механизм подавляющего действия азитромицина на биопленки может быть связан с его влиянием на LasI–LasR и RhlI–RhlR системы кворум-сенсинга [14]. Важным преимуществом азитромицина в лечении пациентов с тяжелыми инфекциями, сепсисом, пациентов в послеоперационном периоде и находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии и/или на искусственной вентиляции легких является возможность его внутривенного применения. Вводится азитромицин в виде внутривенной инфузии продолжительностью не менее 1 ч в дозе 500 мг 1 раз в сутки. Такая терапия позволяет в дальнейшем перейти на пероральный прием препарата в случае стабилизации состояния после 5 дней начальной терапии. Противопоказаниями к применению азитромицина являются повышенная чувствительность к нему и другим препаратам группы макролидов, тяжелая печеночная недостаточность класса С по Чайлд–Пью, тяжелая почечная недостаточность с клиренсом креатинина менее 40 мл/мин, возраст до 12 лет при массе тела до 45 кг, грудное вскармливание и одновременный прием алкалоидов спорыньи. Для оригинального парентерального азитромицина, представленного в России под торговым наименованием Сумамед®, противопоказания возрастных ограничений распространяются лишь до 12 лет при массе тела до 45 кг. В отличие от эритромицина и кларитромицина, этот антибактериальный препарат характеризуется минимальным уровнем лекарственных взаимодействий и отсутствием значимого негативного влияния на желудочно-кишечный тракт [15]. Из нежелательных реакций можно отметить тошноту, метеоризм, диарею, анорексию, кожные высыпания, эозинофилию, головную боль, головокружение, нарушение вкуса, четкости зрения, слабость. В целом азитромицин хорошо переносится, является безопасным и эффективным антибактериальным препаратом, обладающим уникальным на сегодняшний день свойством – способностью препятствовать образованию и вызывать уменьшение массы уже сформировавшейся биопленки.

About the authors

D. A Sychev

References

Supplementary files