Патогенетические особенности повреждения слизистой оболочки пищевода при гастроэзофагеальной рефлюксной болезни

Полный текст

Согласно последним эпидемиологическим данным в мире отмечается неуклонный рост распространенности кислотозависимых заболеваний желудочно-кишечного тракта, среди которых лидирующие позиции занимает гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) [1]. Актуальность большинства исследований, посвященных данной проблеме, обусловлена значительным снижением качества жизни пациентов с ГЭРБ и высокими рисками осложненного течения [2]. Так, длительная экспозиция и агрессивный характер рефлюктата приводят к эрозивно-язвенным поражениям слизистой оболочки пищевода (СОП) и развитию таких грозных осложнений, как пептическая стриктура пищевода, кровотечения, пищевод Барретта (ПБ) [3]. Современные представления о ГЭРБ как о кислотозависимом заболевании формализуют применение в качестве базисных препаратов с кислотосупрессивным эффектом. Однако при этом резистентность к такой медикаментозной терапии составляет от 10 до 40%, что, по мнению S.Jürgens и соавт. (2012 г.), связано с особенностями состава гастроэзофагеального рефлюктата [4]. Кроме этого, хорошо известно, что результат влияния патологического рефлюкса на СОП также определяется длительностью воздействия и собственной резистентностью слизистой пищевода. Установлен высокий деструктивный потенциал кислого характера рефлюктата, отличающийся от щелочного механизмами повреждения СОП [3, 5]. Впервые повреждающее действие щелочного рефлюкса описано в работе F.Сross и соавт. (1951 г.) [6], где было показано, что желчные кислоты в рефлюктате приводят к эрозивному эзофагиту. Более того, ряд клинических исследований [7-9] подтвердил роль щелочного рефлюктата в формировании резистентного течения ГЭРБ, развитии метаплазии эпителия ПБ с последующей трансформацией в аденокарциному пищевода. При этом установлено, что в основе патогенетического механизма токсического действия желчных кислот на СОП лежит модуляция процессов апоптоза, пролиферации, клеточной дифференцировки и синтеза воспалительных цитокинов [7, 9]. Так, под воздействием щелочного рефлюктата происходят повреждение ДНК эпителиоцитов пищевода с последующим нарушением регуляции генов, вовлеченных в их цилиндрическую и/или плоскоклеточную дифференцировку, а также синтез оксида азота, который, в свою очередь, снижая экспрессию изоформ p53, способствует стратификации плоского эпителия и увеличивает экспрессию CDX2 - фактора интестинальной дифференцировки. Именно таким образом, по мнению M.Abdel-Latif (2016 г.), рефлюкс дуоденального содержимого запускает перепрограммирование в экспрессии ключевых факторов транскрипции и процесс трансдифференцировки [10]. Установлено, что у пациентов с верифицированным ПБ длительная экспозиция желчных кислот в пищеводе генерирует свободные радикалы и активирует NF-κB, инициируя неконтролируемый апоптоз в отношении неповрежденной СОП [11]. Однако фрагментарность исследований роли характера рефлюктата в патогенезе заболевания диктует поиск инновационных методик, направленных на детализацию молекулярных механизмов влияния биологических жидкостей с различным рН на СОП, структуру протеома и состояние межклеточных контактов. К современным биоинформационным возможностям можно отнести протеомное профилирование и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии E-кадгерина. Целью нашей работы явилось изучение у больных с ГЭРБ протеомного паттерна и экспрессии Е-кадгерина в СОП в зависимости от состава патологического гастроэзофагеального рефлюктата. Настоящее исследование выполнено в период с 2016 по 2017 г. на базе консультативно-диагностической поликлиники и гастроэнтерологического отделения клиники ФГБОУ ВО РостГМУ, медицинского центра «Новомедицина» (г. Ростов-на-Дону). На I этапе проводилось комплексное клиническое обследование по стандартному протоколу для пациентов с ГЭРБ [1]. Диагноз верифицирован с использованием клинико-анамнестических данных, инструментальных методов обследования, включающих: видеоэзофагогастродуоденоскопию с детальным осмотром дистального отдела пищевода в режиме NBI, хромовидео-эзофагоскопию с витальным красителем (4% раствор Люголя), биопсией и морфологическим исследованием эзофагобиоптатов; 24-часовую внутрипищеводную pH-импедансометрию. Критериями включения пациентов в исследование являлись: амбулаторные и стационарные больные с диагнозом ГЭРБ и ПБ в возрасте от 18 до 55 лет, ограничение приема антисекреторных препаратов в течение 1 мес. Ранжирование больных проводилось в зависимости от результатов 24-часовой внутрипищеводной pH-импедансометрии, демонстрирующих особенности преобладающего характера рефлюктата. Сформированы две исследовательские когорты больных: 1-я группа - 39 пациентов (16 женщин и 23 мужчины, средний возраст 48,2±14,3 года) с кислым и слабокислым характером рефлюктата, 2-я группа - 25 больных (11 женщин, 14 мужчин, средний возраст 43,2±12,2 года) с щелочным и слабощелочным рефлюксом. В 1-й группе преобладали пациенты с градацией эрозивного эзофагита А и В, во 2-й доминировали больные с эрозивным эзофагитом градации С, D и ПБ (Лос-Анджелесская классификация рефлюкс-эзофагита, 1994). Группу сравнения составили 20 здоровых добровольцев. На II этапе осуществлялось протеомное и ИГХ-исследование эзофагобиоптатов, полученных в ходе эндоскопического исследования из дистальной части пищевода. Для предварительного фракционирования образцов СОП использовали стандартные наборы для профилирования, содержащие магнитные микрочастицы с различными поверхностями MB-HIC C8, MB-IMAC Cu, MB-WСХ, согласно методике производителя (Bruker Daltonics, Германия). Подготовка к проведению масс-спектрометрического анализа состояла в следующем: элюаты наносили на стальную мишень AnchorChipTM, после высушивания на воздухе образец покрывали раствором матрицы. В качестве последней использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной и α-цианогидроксикоричной кислот в смеси метанол/ацетонитрил/вода (5:4:1). Масс-спектры получали с использованием тандемного MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) масс-спектрометра Ultraflex II (Bruker Daltonics, Германия). Спектры калибровали с помощью внешних стандартов, представляющих смесь белков и пептидов с известными массами (Bruker Daltonics, Германия). Каждый масс-спектр был проанализирован программами FlexAnalysis 3.0 и ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Идентификацию белков и пептидов проводили путем поиска соответствующих кандидатов в базах данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) и Swiss-Prot/UniProt с использованием программы Mascot Search (v 2.1, Matrix Science, Великобритания). Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс-покрытия не менее 60%. ИГХ-исследование эзофагобиоптатов осуществлялось по стандартной методике стрептавидин-биотиновым методом с использованием моноклональных мышиных антител к Е-кадгерину (Dako, США). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере с рН 6,0. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Маейра в течение 15-60 с. Оценка интенсивности экспрессии молекул Е-кадгерина дана полуколичественным методом (от 0 до 3 баллов) в различных эпителиальных структурах: в многослойном плоском эпителии, покровном эпителии железистого типа, зонах кишечной метаплазии [12]. Для статистического анализа полученных данных использовался пакет модулей программы Statistiсa 10.0 for Windows (StatSoft, США). Величины, подчиняющиеся нормальному распределению, представлены в виде выборочного среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m). Величины, не подчиняющиеся нормальному распределению, описывались медианой (Me), нижней (Q 0,25) и верхней (Q 0,75) квантилью, минимальным (Min) и максимальным (Max) значениями. Проверка распределений на соответствие нормальному закону проводилась на основе критерия Колмогорова-Смирнова. Во всех процедурах статистического анализа пороговый уровень значимости различий принят р=0,05. У больных с ГЭРБ выделены и типированы девять протеинов, ответственных за формирование цитоскелета и пролиферацию эпителиоцитов, а также участвующих в сложных каскадах воспалительных процессов в СОП (табл. 1). При сопоставлении протеомного профиля СОП больных с ГЭРБ и здоровых волонтеров совпадений белкового профиля не выявлено. Результаты анализа протеомного паттерна в зависимости от характера патологического рефлюктата показали, что в группе пациентов с преимущественно кислым рефлюксом зарегистрирована экспрессия трех белков: винкулин, кальпонин-1, цистатин C (табл. 2). Винкулин (vinculin) - актинсвязывающий белок, преимущественно локализующийся в области кадгеринопосредованных межклеточных соединений и интегриновых рецепторов клеточной мембраны. Белок играет ключевую роль в формировании фокальной адгезии, пролиферации клеток и регуляции актин-цитоскелета. Ранее B.Lifschitz-Mercer и соавт. (1997 г.) установили, что белок играет протективную роль при повреждении, его повышенная экспрессия связана с нарушением целостности слизистой пищевода, а ее снижение зарегистрировано при аденокарциноме пищевода [13]. Кальпонин-1 (calponin-1) является основным белком гладкомышечных клеток, обеспечивающим стабильность цитоскелета. Цистатин С - член ингибиторов цистеиновых протеаз, снижает активность катепсина В, тем самым предотвращая глубокое повреждение слизистой оболочки. Таким образом, основным механизмом повреждающего действия кислого рефлюктата является нарушение целостности цито-скелета. В клинических исследованиях C.Legendre и соавт. (2014 г.), J.Phelan и соавт. (2016 г.) продемонстрировано, что в основе патологического воздействия желчных кислот на СОП лежат процессы гипоксии, сопровождающиеся экспрессией белка-1, стимулируемого гипоксией, прихибитина-2, тиоредоксина [14, 15]. Нами получены аналогичные результаты, что дополняет имеющуюся базу данных. Следует подчеркнуть, что гипоксия является бластогенным фактором c высоким злокачественным потенциалом. Белок-1, стимулируемый гипоксией (Hypoxia-inducible factor 1-alpha), является активатором ангиогенеза и одним из триггеров развития апоптоза эпителиоцитов СОП, при этом его экспрессия напрямую коррелирует с активностью тиоредоксина. В свою очередь, тиоредоксин (thioredoxin), относящийся к классу малых окислительно-восстановительных молекул, которые экспрессируются почти во всех тканях организма, имеет важное значение для жизнеспособности клетки, регулирует активность апоптоза через сигналрегулирующую киназу-1 и протеинкиназы. Прихибитин-2 (prohibitin-2) участвует в регуляции прогрессии клеточного цикла, может подавлять репликацию ДНК, снижать оксидативный стресс. Таким образом, в основе повреждающего действия щелочного рефлюктата лежат процессы тканевой и клеточной гипоксии, инициирующие апоптоз клеток СОП, и процессы пролиферации клеток базальной мембраны пищевода [14]. Если оценивать последствия обнаруженного нами изменения экспрессии белков при ГЭРБ, то они в подавляющем большинстве имеют отрицательный характер. Вне зависимости от характера рефлюктата у больных с ГЭРБ имеют место нарушения межклеточного взаимодействия, изменения пролиферативной активности слизистой оболочки и активация оксидативного стресса. Известно, что основным компонентом плотных межклеточных контактов, выполняющим важную роль в поддержании нормальной гистоархитектоники эпителиальных тканей, является E-кадгерин [16]. Первые работы, посвященные роли Е-кадгерина в прогрессировании ГЭРБ, были проведены в 1994 г. J.Jankowski и соавт. и показали, что экспрессия Е-кадгерина снижается в метапластических и диспластических клеточных линиях [17]. Однако в ряде последующих исследований получены неоднозначные результаты об изменении экспрессии Е-кадгерина при различных формах и градациях ГЭРБ [18, 19], что подчеркивает актуальность изучения этого биомаркера клеточной адгезивности. В ходе исследования было установлено, что экспрессия Е-кадгерина регистрировалась на мембране эпителиальных клеток. Для оценки степени выраженности нарушений межклеточных контактов экспрессия Е-кадгерина оценивалась в таких структурах, как: многослойный плоский эпителий, покровный железистый эпителий и зоны кишечной метаплазии. Полуколичественная оценка экспрессии Е-кадгерина 3 (+++) отражает состоятельность эпителиального барьера, 1 (+) - проявление выраженных нарушений гистоархитектоники. В 1-й группе у 7 (17,9%) больных была выявлена кишечная метаплазия СОП. При анализе мембранной экспрессии Е-кадгерина в многослойном плоском эпителии у 21 (65,6%) человека мембранная экспрессия Е-кадгерина была выражена умеренно (2++), 6 (15,3%) - резко выражена (3+++) и 5 (12,8%) - резко снижена (1+); рис. 1. В покровном железистом эпителии кардиального отдела пищевода в большинстве случаев (у 21 пациента, 65,6%) отмечена умеренная (2++) мембранная экспрессия Е-кадгерина, резко выраженная экспрессия (3+++) наблюдалась у 11 (33,7%) больных (рис. 2). В зонах кишечной метаплазии в 5 (71,6%) случаях отмечена умеренно выраженная (2++) мембранная экспрессия Е-кадгерина, у 1 (14,2%) больного - слабовыраженная (1+), 1 (14,2%) - резко (3+++); рис. 3. Таким образом, кислый рефлюкс не оказывает выраженного влияния на межклеточные контакты, что подтверждается умеренным уровнем экспрессии Е-кадгерина у большинства пациентов 1-й группы. У пациентов 2-й группы были зарегистрированы более существенные различия рассматриваемого показателя. В многослойном плоском эпителии у 12 больных выраженность экспрессии Е-кадгерина распределялась в равной степени между умеренной (2++; 43%) и резко выраженной (3+++; 43%), у 2 (14%) человек была резко снижена - 1+ (рис. 4). Экспрессия Е-кадгерина в железистом эпителии у больных, у которых он был представлен в биоптатах (8 человек, 60%), была резко снижена - 1+ (рис. 5). Кишечная метаплазия в СОП была констатирована в 11 (44%) случаях, при этом в измененном эпителии отмечено резкое снижение экспрессии Е-кадгерина: так, умеренная экспрессия (2++) выявлена у 3 (25%) пациентов, у 8 (75%) она носила характер мелких фокусов (1+); рис. 6. Выявленные изменения экспрессии Е-кадгерина свидетельствуют о большем повреждающем воздействии щелочного рефлюктата на СОП. Таким образом, у 46% пациентов обеих групп выявлено снижение мембранной экспрессии Е-кадгерина как в покровном железистом эпителии, так и в зонах кишечной метаплазии. Экспрессия Е-кадгерина у всех пациентов, имеющих кишечную метаплазию, снижалась от слабой (1+) до умеренной (2++). Отмечалось значительное снижение экспрессии Е-кадгерина (1+) в зонах кишечной метаплазии у пациентов с рефлюксом желчи относительно всех больных с кишечной метаплазией при кислом и/или слабокислом рефлюксе. Принимая во внимание состав щелочного рефлюктата, представленного желчными кислотами, трипсином, лизолецитином, и механизмы его повреждающего действия - повышение проницаемости клеточной мембраны, влияние на клеточную пролиферацию, апоптоз и дифференцировку, остаются открытыми вопросы расширения стандартного протокола лечения пациентов с ГЭРБ [20, 21]. Особенности протеомного профиля СОП и экспрессии Е-кадгеринов у пациентов с преимущественно щелочным характером рефлюктата позволяют предположить необходимость длительной цитопротективной терапии с использованием урсодезоксихолевой кислоты (УДХК) [22, 23]. Обоснованность данного предложения подтверждается целым рядом исследований. Так, J.Амaral и соавт. (2009 г.) были получены данные, достоверно показывающие, что применение препаратов УДХК позволяет ингибировать классические пути апоптоза и регулирует процессы окислительного стресса [23]. Клиническая эффективность дифференцированного подхода к терапии ГЭРБ с учетом характера рефлюктата была продемонстрирована в исследовании Н.Б.Лищук и соавт. «ВозможноСТи ОПтимизации диагностики и терапии различных вариантов ГастроЭзофагеальной Рефлюксной Болезни» (2017 г.). Оценивая 6-недельный курс терапии ГЭРБ Урсосаном и Итомедом, авторы формулируют вывод о том, что комбинированное назначение прокинетиков и препаратов УДХК у пациентов с преобладанием слабощелочных рефлюксов оказывает благоприятное влияние на клинико-эндоскопическую картину и моторику верхних отделов желудочно-кишечного тракта [22]. Таким образом, современные биоинформационные диагностические подходы обеспечивают возможность представления более детализированной оценки патогенетических изменений в СОП при ГЭРБ. Анализ характерных особенностей повреждения слизистой пищевода в зависимости от характера рефлюктата определяет и содержание патогенетической терапии. Полученные данные указывают на возможность расширения стандартного протокола лечения ГЭРБ путем включения препаратов УДХК.

Об авторах

Галина Николаевна Тарасова

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: doctor-gastro@yandex.ru
д-р мед. наук, проф. 344022, Россия, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., д. 29

Елизавета Александровна Смирнова

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России

аспирант каф. пропедевтики внутренних болезней 344022, Россия, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., д. 29

Список литературы

Дополнительные файлы