Beta-adrenoblokatory: vozmozhnosti rasshireniya pokazaniy k primeneniyu

Full Text

История внедрения b-адреноблокаторов (БАБ) начинается с работ R.Ahlquist, который в 1948 г. предположил, что стимулирующее действие катехоламинов на сердечно-сосудистую систему опосредуется двумя типами адренорецепторов. В конце 50-х годов были проведены первые исследования по созданию лекарственных препаратов, которые бы подавляли стимулирующие эффекты катехоламинов на сердце [1]. В 1964 г. в Британском медицинском журнале появились первые сообщения о применении пропранолола при лечении стенокардии и артериальной гипертензии. Руководителем работ, приведших к созданию в начале 60-х годов первых БАБ, был J.Black, который в 1988 г. за свои работы в этой области был удостоен Нобелевской премии. В клинической практике БАБ применяются уже почти 40 лет. Препараты с успехом используются для терапии нескольких десятков заболеваний, и список их постоянно пополняется. Кроме сердечно-сосудистых заболеваний, БАБ оказались весьма полезными при лечении тиреотоксикоза, мигрени, тревожных состояний, абстинентного синдрома, отдельных видов тремора и некоторых других состояний. БАБ являются препаратами выбора при лечении артериальной гипертензии (АГ). Это подтверждается перечнем ранних рекомендаций по антигипертензивной терапии, опубликованных Всемирной организацией здравоохранения и Международным обществом по гипертонии в 1983 г. [2] и Объединенным национальным комитетом США в 1985 г. [3]. Применение БАБ как базисных антиангинальных препаратов в лечении больных с острым коронарным синдромом, инфарктом миокарда не вызывает сомнений [4–6]. В 1982 г. P.Erhardt и соавт. синтезировали новый внутривенный селективный b1-адреноблокатор ультракороткого действия эсмолол, что значительно расширило клинические возможности для применения БАБ. Фармакокинетический профиль эсмолола отражает его ультракороткое действие. Полный терапевтический эффект развивается через 2 мин и прекращается через 15–20 мин после завершения инфузии. Полупериод его распределения и выведения очень короткий (9 мин), в то время как периоды полувыведения других БАБ гораздо дольше. Уникальная кинетика эсмолола позволяет более быстро и предсказуемо титровать его до желаемого уровня b-блокады, что дает большую свободу маневра в его применении в зависимости от клинической ситуации. Эсмолол успешно используется для лечения нарушений ритма, гипертонических кризов, ишемии миокарда. Эсмолол занимает важное место в лечении больных с нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда (ИМ). Еще до широкого применения тромболизиса раннее внутривенное введение БАБ при остром ИМ улучшало прогноз больных. Это было отражено в работе S.Yusuf и соавт., которая представляла метаанализ данных 28 клинических исследований с общим числом пациентов, равным примерно 28 000. Результаты показали, что указанный подход применения БАБ достоверно снижал смертность в раннем постинфарктном периоде на 13%, число рецидивов инфаркта миокарда на 20% и частоту возникновения фибрилляции желудочков на 15% [6]. В последние годы было четко показано, что добавление БАБ улучшает прогноз больных хронической сердечной недостаточностью (ХСН). Несмотря на это, по утверждению экспертов Европейского общества кардиологов (ЕОК), только в среднем 13% (0,5–54%) больных получают БАБ в острую фазу инфаркта миокарда, дальнейшее лечение БАБ было рекомендовано 52% (33–81%) больных [7, 8]. По данным других авторов, терапию БАБ получают всего от 21 до 34% больных, перенесших ИМ [9]. Кардиологи назначают эти препараты менее чем половине пациентов, которым они подходят [10]. В нашей стране, по данным регистра GRACE, внутривенные БАБ получают всего 2,9% больных без подъема сегмента ST, с подъемом сегмента ST – 4,3%, а при выписке из стационара БАБ рекомендуются 50,7 и 54,5% больных соответственно. С чем связано ограниченное применение БАБ? По мнению ряда исследователей, это связано с укоренившимися представлениями о частых негативных сторонах действия БАБ. К наиболее встречаемым причинам, ограничивающим применение БАБ, относятся пожилой возраст, обструктивные заболевания легких, тяжелая сердечная недостаточность, сахарный диабет, стенозирующие заболевания периферических сосудов (или развитие синдрома Рейно как одного из побочных явлений адреноблокаторов, или как составная часть каких-то других заболеваний), возможность развития импотенции, брадикардии и AV–блокады [10, 11]. Полученные положительные результаты многочисленных исследований эффективности применения БАБ по основному показателю – снижению смертности и улучшению качества жизни больных ишемической болезнью сердца (ИБС), ИМ, АГ и сердечной недостаточностью – заставили исследователей продолжить изучение возможности расширения показателей для назначения БАБ [12–21]. Считается, что с возрастом, учитывая анатомо-физиологические особенности, увеличивается риск развития осложнений при терапии БАБ. Это приводит к тому, что во многих международных исследованиях, посвященных изучению эффективности БАБ, существуют ограничения по включению пациентов пожилого и старческого возраста, несмотря на показания к их применению. Так, в специальном исследовании (Cooperative Cardiovascular Project – ССР) показано, что частота применения БАБ в стационаре у больных острым ИМ в возрасте от 75 до 85 лет падает с 36,9 до 26,7% [8, 9]. В амбулаторных условиях этот показатель еще ниже и составляет 8%. Тем не менее в этом же исследовании показано, что БАБ сохраняют свою эффективность у больных даже самого пожилого возраста. Так, смертность пациентов старше 80 лет, получавших БАБ в постинфарктном периоде, была на 32% меньше, чем у пациентов того же возраста, не получавших этой терапии [9, 12, 17]. В многочисленных исследованиях по изучению эффективности БАБ у больных после ИМ, в которых пациентов включали без учета ограничения возраста, показано, что они сохраняют свою эффективность у больных пожилого возраста [9]. Исследование SHEP было разработано для изучения антигипертензивной терапии у пациентов старше 60 лет с изолированной систолической гипертонией. Начальная терапия состояла из хлорталидона в малой дозе, при необходимости добавляли атенолол. Контрольная группа получала соответствующее плацебо. Участвовали 4736 пациентов, средняя продолжительность наблюдения 4,5 года. Риск инсульта снизился на 36%, ИМ или коронарной смерти – на 27%. Лечение в целом переносилось хорошо, с одинаковыми побочными эффектами в контрольной и основной группах [18]. В двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании STOP-hypertension участвовали 1627 пациентов в возрасте от 70 до 84 лет, активным препаратом был любой БАБ (атенолол, метопролол или пиндолол) или диуретик (гидрохлортиазид + амилорид). В двух третях случаев терапия была комбинированной (БАБ и диуретик) и хорошо переносилась. В результате с высокой степенью достоверности получено, что частота инсультов уменьшилась на 47%, общая смертность – на 43% [22]. Таким образом, эти исследования показали высокую эффективность и хорошую переносимость БАБ при отдельном их применении либо с другими препаратами у лиц до 80 лет и старше. Наиболее серьезным препятствием к назначению неселективных и в меньшей степени селективных b1-адреноблокаторов является наличие сопутствующих хронических обструктивных болезней легких (ХОБЛ) и бронхиальной астмы (БА). Однако результаты исследования ССР показывают, что риск смерти в течение 2 лет у больных ХОБЛ, перенесших ИМ, без терапии БАБ составляет 27,8%, на фоне лечения БАБ – всего 16,8%. Снижение риска смерти таких больных на фоне терапии этими препаратами составляет 40%. В США даже среди больных БА после ИМ 17,7% пациентов получают терапию БАБ [10, 11]. В ряде работ изучено влияние бисопролола на показатели функции внешнего дыхания (ФВД) у больных с ХОБЛ и стабильной стенокардией, ХОБЛ и ИМ. Авторы отмечают, что при применении 20 мг бисопролола показатели бронхиальной проходимости были сравнимы с показателями после приема плацебо, а прием 10 мг не оказывал негативного влияния на проходимость бронхов [11, 23]. Форсированная жизненная емкость легких на фоне терапии бисопрололом не уменьшалась, а определялась даже тенденция к улучшению этого показателя. Авторы связывают это с благоприятным влиянием бисопролола на функциональное состояние левого желудочка [11, 24]. В других исследованиях с метопрололом (C.Lofdahl и соавт. Eur J Clin Pharmacol 1988; Suppl. 33: 25–32) и небиволол (M.Cazzola и соавт. Chest 2000; 118: 1322–6) продемонстрировано их нейтральное влияние на бронхиальную проходимость у больных БА, в отличие от атенолола, который ухудшал показатели ФВД. В исследованиях Mattheys и соавт., Z.Kardiol (2002 г.) сравнивали небиволол с плацебо по влиянию на бронхиальную проходимость. Продемонстрировано, что влияние небиволола на форсированную жизненную емкость легких сопоставимо с плацебо и ни у одного больного не было зарегистрировано бронхоспазма. Эффективность БАБ в зависимости от пола у больных ХСН. Имеются данные о том, что и другие кардиоселективные БАБ при правильном их применении не вызывают бронхообструкцию у больных ХОБЛ. Это показано в отношении метопролола и эсмолола. Так, в 1991 г. опубликована работа, свидетельствующая о безопасности применения эсмолола при сердечно-сосудистой патологии (нестабильная стенокардия, острый ИМ, аритмии, гипертония) у больных с ХОБЛ [25]. Применение препарата у 50 больных, более половины которых имели умеренную или выраженную обструкцию дыхательных путей, не выявило каких-либо значимых отклонений параметров ФВД. Негативное влияние БАБ на бронхиальную проходимость обратно пропорционально степени кардиоселективности [26], при этом следует учитывать, что степень кардиоселективности неодинакова у различных препаратов. Индекс кардиоселективности характеризует ее степень, для пропранолола – 1,8:1; для атенолола и бетаксолола – 1:35; для метопролола – 1:20, для бисопролола – 1:75 [26]. В исследование K.Brixius и соавт. (Br J Pharmacol 2001; 133: 1330–8) при изучении кардиоселективности различных БАБ показано, что самой высокой кардиоселективностью обладает небиволол. Конечно, у части больных может быть ухудшение бронхиальной проходимости, в этом случае препарат необходимо отменить, но, следуя мнению S.Gottlieb [7], одно лишь подозрение на наличие гиперчувствительности к БАБ и отсутствие однозначных признаков БА или бронхоспазма делают возможной хотя бы попытку применения препаратов у таких пациентов. Надо помнить, что причина бронхоспазма может быть различна (отек стенок бронхов и бронхиол, рубцовая их деформация, нарушение эвакуации бронхиального содержимого), и БАБ не всегда обязательно провоцируют это осложнение, а реальный шанс продлить жизнь больного будет достаточным оправданием риска. Проведенные многочисленные работы с БАБ у больных ХОБЛ продемонстрировали свою безопасность, но это касается только трех препаратов – бисопролола, метопролола и небиволола. В связи с этим можно говорить о том, что при необходимости ББ могут применяться у данной категории пациентов. Возможно, завтра мы будем свидетелями расширений показаний для кардиоселективных БАБ. Обычно в перечне противопоказаний к применению этой группы препаратов указывают на перемежающуюся хромоту при атеросклеротическом поражении артерий нижних конечностей. Но это не всегда оправдано, так как ББ оказывают двухфазное действие на тонус сосудов: непосредственно после первого введения препарата развивается рефлекторное повышение периферического сопротивления в ответ на уменьшение сердечного выброса, однако при продолжающемся его приеме наблюдается постепенное снижение их тонуса. Артериолы и венулы скелетной мускулатуры в гораздо большей степени зависят от a-адренорецепторов, обеспечивающих констрикторное влияние. Поэтому b2-блокаторы, если не происходит значительного снижения артериального давления, не оказывают существенного влияния на течение перемежающей хромоты и могут успешно применяться у подавляющего большинства пациентов с сопутствующим атеросклеротическим поражением артерий ног. Микроциркуляция кожи в большей степени зависит от b1-адренорецепторов, локализованных в прекапиллярных сфинктерах. С этим связывают риск развития осложнений от применения БАБ при заболеваниях с ангиоспастическим механизмом (например, болезнь Рейно), особенно на фоне a-стимуляции, а также при нарушении кровоснабжения кожи. Этим можно объяснить редкие случаи возникновения некрозов кожи, осложняющих лечение как селективными, так и неселективными БАБ. Но в большей степени это относится к неселективным формам или к некоторым селективным препаратам I, II поколения. Так, например, при изучении на добровольцах влияния на микроциркуляцию бисопролола и атенолола в суточной дозе 20 и 100 мг соответственно было получено достоверно значимое уменьшение адреналининдуцируемой вазодилатации на фоне приема атенолола, чем после приема бисопролола [27, 28]. Современную медицину сердечно-сосудистых заболеваний нельзя рассматривать без изучения нарушений метаболических процессов. Исследования последних лет с помощью клэмп-метода показали, что большинство лекарственных средств, применяемых в кардиологии, изменяют чувствительность клеток к инсулину согласно изменениям атерогенного липидного профиля (дислипидемия, ожирение, нарушение толерантности к глюкозе, гиперинсулинемия). Имеются данные, что a1-блокаторы и ингибиторы АПФ либо не влияют, либо улучшают чувствительность к инсулину и атерогенный профиль липидов, тогда как большинство блокаторов кальциевых каналов метаболически инертны. Диуретики и БАБ снижают чувствительность к инсулину и усугубляют дислипидемию. Механизмы неблагоприятного побочного действия БАБ до конца не изучены. Возможно, блокаторы адренорецепторов ухудшают чувствительность к инсулину и между ними, вероятно, имеются различия. Прежде всего эти различия проявляются во влиянии их на изменения липопротеинового спектра. Однако негативные эффекты наблюдаются не у всех БАБ. Так, в двойном слепом исследовании по изучению влияния бисопролола (5 мг в день 4 мес) и ингибитора АПФ лизиноприла (5 мг/день 4 мес) на изменение уровня инсулинорезистенции выявило, что этот показатель был лучше у бисопролола, чем у лизиноприла [29, 30]. При сравнительном изучении в группе БАБ выявлено, что селективные, такие как атенолол и метопролол, снижают чувствительность к инсулину примерно на 25%, пропроналол – на 30%, а бисопролол увеличивает на 10% [31]. Ряд других многоцентровых исследований посвящен изучению влияния БАБ на уровень липротеидов низкой и высокой плотности, холестерина и триглицеридов. Было убедительно доказано, что пропранолол и атенолол повышают уровень триглицеридов на 25% (p<0,01) и 18% (p<0,05), общего холестерина на 9% (p>0,05) и 8% (p>0,05) и понижают липопротеиды высокой плотности на 10% (p<0,05) и 9% (p<0,05) соответственно. В отличие от них бисопролол не оказывал влияния на общий холестерин и триглицериды, а уровень липопротеидов высокой плотности достоверно возрастал на 9% (p<0,05) [32–34]. В недавно опубликованном исследование GEMINI (Glycemic Effects in Diabetes Mellitus: CarvedIlol–Metoprolol Tartrate ComparisoN in HypertensIves) продемонстрировано, что карведилол в отличие от метопролола тартрата у больных сахарным диабетом достоверно уменьшал общий холестерин на 4,6% (p<0,001) и не влиял на уровень триглицеридов. На фоне терапии метопролола тартратом уровень триглицеридов достоверно увеличивался на 13,7%; p<0,0001 (Bakris и соавт. JAMA 2004; 292: 2227–36). Около 40 лет назад E.Braunwaid и соавт. [35], используя флюорометрический метод, определили, что у больных с сердечной недостаточностью обнаруживаются повышенные концентрации норадреналина в плазме крови, в то время как сердечный пул нейротрансмиттеров истощается. При этом нейротрансмиттеры оказывают положительный инотропный эффект, стимулируя ослабленное сердце, и индуцированная ими вазоконстрикция помогает поддерживать кровоток в жизненно важных органах в условиях значительного снижения сердечного выброса [36]. Механизмы взаимодействия симпатоадреналовой системы (САС) и поражения сердца более сложные. В частности, хроническое и избыточное воздействие на сердце норадреналина приводит к гипертрофии, ишемии и повреждению миоцитов [37–39]. У больных с ХСН (или систолической сердечной недостаточностью) имеется нарушение двух основных механизмов – это снижение насосной функции сердца и хроническая гиперактивность САС. Гипотеза о том, что САС играет отрицательную роль в развитии сердечной недостаточности, также подтверждается благоприятным влиянием БАБ, которые, снижая частоту сердечных сокращений (ЧСС), уменьшают потребность миокарда в кислороде и тем самым защищают кардиомиоциты от гибели (некроз и апоптоз). У здоровых людей увеличение ЧСС сопровождается увеличением контрактильности миокарда – так называемый феномен Bowdich-Treppe. При ХСН происходят изменения, которые включают снижение активности энзимов, регулирующих гомеостаз кальция. Подавляется функция кальциевой АТФазы в саркоплазматическом ретикулуме и возрастает активность сарколеммального натрий-кальциевого обмена. Это сопровождается изменением кальциевого гомеостаза с уменьшением диастолического захвата кальция в саркоплазматическом ретикулуме с последующим уменьшением высвобождения кальция во время следующей систолы, что приводит к уменьшению контрактильности миокарда. Выброс внутриклеточного кальция во внеклеточное пространство делает ионы кальция недоступными для включения в цикл сокращения. В результате этих специфических фенотипических трансформаций изменяется соотношение “сила сокращений/частота сокращений", что и приводит к снижению сократительной функции при возрастании ЧСС. При этом оптимальное соотношение может наблюдаться при частоте сокращений 30 уд/мин [40, 41]. Обзор результатов крупномасштабных клинических исследований говорит о том, что БАБ снижают риск госпитализации и смерти у больных с мягкой и умеренной сердечной недостаточностью [38, 42–45]. Сегодня можно говорить о том, что отсутствие БАБ в комплексной терапии ХСН не оправданно, так как врач уменьшает шансы своего пациента на улучшение течения сердечной недостаточности и продление его жизни. Во всех международных и национальных рекомендациях указано, что только три БАБ могут использоваться в лечении ХСН: бисопролол, карведилол и метопролол сукцинат. Что же касается применения метопролола тартарт при лечении ХСН, то результаты исследования COMET показали, что метопролол тартарт проиграл карведилолу, общая смертность на фоне терапии карведилолом была на 17% (p=0,0017) меньше, чем в группе метопролола. Учитывая это, метопролол тартарт не был включен в национальные рекомендации по лечению ХСН. В настоящее время имеются следующие рекомендации по применению БАБ у пациентов с ХСН [37, 38, 43]: 1. Использование только дополнительно к ингибиторам АПФ. 2. Применение только у больных, находящихся в состоянии компенсации. 3. Применение начиная с малых доз (1/8 среднетерапевтической), с медленным (до 6 мес) титрованием. Преодоление периода титрования позволяет БАБ в процессе длительного лечения достоверно продлевать жизнь декомпенсированным больным за счет снижения как частоты внезапной смерти, так и летальности от прогрессирующей декомпенсации за счет нескольких механизмов, в том числе возрастания фракции выброса левого желудочка. При этом прирост этого показателя в среднем достигает 7%, что не меньше, чем при лечении дигоксином. Первым объяснением, по мнению авторов, проводивших исследование по изучению влияния БАБ в сочетании с ингибиторами АПФ и изолированно, служит улучшение сократимости тех зон миокарда, которые находились в состоянии гибернации за счет "экономии" кислорода или уменьшения потребности миокарда в питании в ответ на отрицательное инои хронотропное действие БАБ. На I конференции по сердечной недостаточности были доложены результаты о достоверном уменьшении количества зон гипокинезии с 68 до 41% за 6 мес лечения бисопрололом. Этот механизм наиболее вероятен у больных, перенесших ИМ [40]. Нейрогуморальные ответы при ХСН практически идентичны и не зависят от этиологического фактора. Убедительно доказана высокая эффективность БАБ у больных с ДКМ. В связи с этим на I Международном совещании рабочей группы по сердечной недостаточности (Амстердам, 1995 г.) рекомендовано применение БАБ у больных с ДКМ. Американская Программа исследований по карведилолу у больных с сердечной недостаточностью (US Carvedilol Heart Failure Trials program), рандомизированное исследование метопролола CR/XL (MERIT-HF) и исследование бисопролола при сердечной недостаточности (CIBIS П) были остановлены досрочно благодаря значительному снижению уровня смертности в группах, получавших активный препарат [16, 31]. При проведении метаанализа 22 исследований, в том числе и исследование COPERNICUS, в которые вошли более 13 тыс. больных с сердечной недостаточностью, соотношение шансов для летального исхода при приеме БАБ составило 0,65, а для госпитализации по причине сердечной недостаточности – 0,64, т.е. на каждые 100 пациентов, леченных БАБ, удается спасти 3,8 жизни и избежать 4 случая госпитализации. Эти результаты были получены при лечении как селективными, так и неселективными БАБ. Сегодня продолжается поиск новых БАБ для лечения ХСН. Недавно завершилось исследование SENIORS (Study of Effects of Nebivolol Intervention on Outcomes and Rehospitalisation in Seniors with Heart Failure), в котором изучали применение небиволола у больных пожилого возраста с ХСН (Kitzman и соавт., AJC 2001). SENIORS значительно отличается от предыдущих исследований по применению b-блокаторов при сердечной недостаточности, таких как CIBIS II, MERIT-HF, COPERNICUS. Средний возраст пациентов в этих исследованиях был 61 год, тогда как в SENIORS – средний возраст был 76 лет. Выборка пациентов, представленная в SENIORS, наиболее точно отражает группу больных сердечной недостаточностью в популяции в целом: по возрастному составу, соотношению мужчин и женщин, по показателям ФВЛЖ. В этом исследовании было получено достоверное снижение на 14% первичной точки (общая смертность и госпитализация) в группе получавших небиволол (p=0,039), при этом общая смертность снизилась недостоверно на 12% (p=0,214). Однако ожидать значительного снижения общей смертности в такой возрастной категории больных нельзя. Если провести сравнение исследований SENIORS, MERIT-HF и CIBIS II по одинаковым критериям включения, т.е. возраст моложе 75 лет и фракция выброса менее 40% (для исследования MERIT-HF) и менее 35% (для исследования CIBIS II), то мы получим очень интересные результаты. Оказывается, по критериям CIBIS II, в исследовании SENIORS общая смертность снизилась на 38%, а по критериям MERIT-HF – на 36%. Безусловно, эти результаты требуют еще изучения и подтверждения в специально спланированном исследовании. Рассмотрим эффективность БАБ в зависимости от пола. На рисунке представлены данные эффективности различных БАБ у больных с ХСН в зависимости от пола [46]. Как видно, бисопролол, карведилол и небиволол в той или иной степени были эффективнее у женщин. Более интересные результаты были получины при анализе эффективности метопролола сукцината и небиволола. Оказывается, метапролол достоверно снижал смертность у мужчин, а небиволол – у женщин. Самое значительное влияние на выживаемость у женщин оказывает бисопролол. Конечно, эти данные требуют дальнейшего изучения и осмысления, а также проведения многоцентрового исследования. До недавнего времени казалось, что все вопросы применения БАБ у больных с ХСН решены. Но возник вопрос, можно ли назначить БАБ до назначения ингибиторов АПФ? В последнее время стали появляться работы, сообщающие о возможности применения БАБ до назначения ингибиторов АПФ. Одними из первых, кто продемонстрировал высокую эффективность монотерапии БАБ карведилола, были Ю.Н.Беленков и В.Ю.Мареев (2001 г.). Исследование ЭКСТАЗ убедительно продемонстрировало, что карведилол по своей эффективности не уступал эналаприлу. В последующим это было подтверждено исследованием CARMEN с карведилолом. На основании имеющихся данных можно предполагать, что БАБ могут оказаться даже более эффективными, чем ингибиторы АПФ у пациентов с ХСН. Однако это только предположение. Для решения поставленного вопроса необходимо проведение многоцентрового исследования. И решение этой задачи возложено на новое исследование CIBIS III с бисопрололом. В этом исследовании участвуют 16 европейских стран, 150 центров. В исследование включены 1000 пациентов с ХСН II–III функционального класса с фракцией выброса менее 35%. Результаты исследования CIBIS III дадут ответы на многие вопросы: возможно ли начинать терапию ХСН бисопрололом, раннее назначение БАБ будет более эффективным, чем раннее назначение ингибиторов АПФ, позволит ли раннее назначение бисопролола снизить летальность от внезапной смерти, будет ли бисопролол более эффективен, чем эналаприл? Таким образом, хотя еще не все вопросы решены, результаты ранее проведенных крупномасштабных исследований определяют соотношение риск/польза при лечении БАБ в пользу более широкого применения этой группы лекарственных средств при лечении кардиологических больных как в виде монотерапии, так и в сочетании с другими препаратами.

About the authors

S. N Tereshchenko

References

Supplementary files