Rol' kandidoznoy bioplenki pri rezistentnoy k antimikotikam kandidemii

Full Text

Актуальность Известно, что некоторые возбудители инфекций, например S. aureus, S. epidermidis и P. aeruginosa, обладают способностью образовывать биопленки – микробные сообщества, соединенные внеклеточным полисахаридом и заключенные в прочный кожух. Биопленки образуются на поверхности внутрисосудистых или мочевых катетеров, а также на эндопротезах различной локализации. Выделяют сессильные (неподвижные) и планктонные (свободно взвешенные, над поверхностью катетера) биопленки [1]. В настоящее время биопленки рассматривают одной из причин резистентности микроорганизмов к противоинфекционным агентам. Считают также, что биопленка – защищенная ниша для бактерий и грибов, где они в безопасности от антибиотиков и антимикотиков и могут создать источник рецидивирующей инфекции [2]. Данные о грибковых биопленках крайне ограничены, причем не только в России, но и за рубежом. В то же время кандидозные биопленки рассматривают как одну из потенциальных причин резистентности микромицетов к антимикотикам [3]. Цель настоящего исследования – анализ собственного клинического наблюдения, а также обобщение данных литературы, посвященных антимикотической терапии биопленок, содержащих Candida spp. Материалы и методы Представлено описание случая развития инвазивного кандидоза (ИК) и кандидозной биопленки у пациента с обширной термической травмой, получившего лечение в ожоговом центре Детской городской больницы (ДГБ) №1 Санкт-Петербурга. В связи с ИК ребенку было последовательно назначено лечение флуконазолом (дифлюкан, «Pfizer Int., LLC», США), дезоксихолатным комплексом амфотерицина В (фунгизон, «Bristol-Myers Squibb Company», США), каспофунгином (Кансидас, «MERCK&Co., Inc.», США). Для постановки диагноза ИК были использованы клинические и лабораторные критерии, предлагаемые Интернациональным консенсусом по диагностике инвазивных микозов у иммуноскомпрометированных больных [4]. Клиническим критерием ИК была персистирующая на протяжении более 96 ч лихорадка, рефрактерная к назначению антибиотиков широкого спектра действия. Микробиологическим критерием ИК было выделение Candida spp. при посеве крови. Согласно клиническим и микробиологическим критериям был установлен доказанный ИК – фунгемия: выделение Candida sp. при посеве крови у пациента с соответствующими клинико-лабораторными признаками инфекционного процесса, связанного с данным возбудителем (повышение температуры тела более 38°С или другие признаки генерализованной воспалительной реакции) [8]. Определение чувствительности выделенных изолятов к флуконазолу проводили методом CLSI (протокол М44-А). Также провели анализ данных литературы по грибковым биопленкам в базах PubMed (с 1980 г. по апрель 2007 г.), Wiley Interscience (на апрель 2007 г.) и Cochrane Library (на апрель 2007 г.). При поиске информации использовали следующие ключевые слова: Candida biofilm; antifungal; antifungal susceptibility of Candida biofilms. Результаты Описание клинического случая Больной Х., в возрасте 16 лет, поступил в ожоговый центр ДГБ №1 в начале января 2007 г. в связи с термическим ожогом тела III–IVБ степени, площадь поражения тела 99%: лицо, голова, грудь, живот, верхние и нижние конечности. Шок 2-й степени тяжести. При поступлении в стационар клиническое состояние ребенка было крайне тяжелым. Поражены лицо, шея, грудь, живот, руки и ноги. Пациент был переведен на искусственную высокочастотную вентиляцию легких (ИВЛ, всего 14 дней), катетеризирован, начата симптоматическая (инотропная, инфузионная, обезболивающая) и антибактериальная (цефтриаксон и амикацин) терапия. Были произведены лампасные разрезы на верхних конечностях и удалены участки пораженного эпидермиса. На раны наложена повязка с дермазином. На 2-е сутки от поступления в ожоговый центр проведена отсроченная радикальная некротомия и первичная свободная ксенопластика. Во время операции был отправлен участок струпа с груди для экспресс-диагностики. Диагностирован некроз всех кожных придатков. Учитывая то, что у ребенка были факторы риска развития ИК, такие как площадь поражения тела более 40%, на 9-е сутки пребывания пациента в условиях отделения реанимации начата профилактика ИК флуконазолом в дозе 6 мг/кг в сутки. Антимикотик вводили парентерально. На 10-е сутки от поступления больного в стационар был удален центральный венозный катетер (ЦВК) и установлен ЦВК длительного стояния “Groshong”. Ребенок лихорадил субфебрильно. Состояние оставалось тяжелым. Получал постоянное парентеральное питание. Из мочи и мокроты была выделена P. aeruginosa, резистентная к цефтазидиму, аминогликозидам, карбапенемам и фторхинолонам. Чувствительность сохранялась только к полимиксину. Пациент был переведен на вспомогательную искусственную вентиляцию легких (ВИВЛ). На 19-е сутки от поступления в стационар, на фоне введения флуконазола, при посеве отделяемого верхних дыхательных путей, а также материала с ожоговой поверхности была выделена Candida spp. Произведена смена антибактериальной терапии – полимиксин Е в сочетании с ванкомицином. Невзирая на то что выделенные изоляты (C. albicans и C. tropicalis) были чувствительны к флуконазолу in vitro, был назначен амфотерицин В в дозе 1,0 мг/кг в сутки. Продолжалось постоянное парентеральное питание. Несмотря на проводимое лечение, сохранялась гипертермия до 39оС. Через 30 дней от поступления в ожоговый центр, на фоне лечения амфотерицином В, из крови однократно был высев С. albicans. Выделенный изолят был чувствителен к флуконазолу in vitro. Противогрибковую терапию амфотерицином В продолжали. Было начато введение пентаглобина. Произведена смена ЦВК. Продолжалась ВИВЛ. При проведении ультразвукового и рентгенологического исследований внутренних органов (почки, печень, селезенка, легкие) очагов инфекции не обнаружено. Произведена вторичная поздняя аутодермопластика на гранулирующие раны верхних конечностей. Учитывая отсутствие повторных высевов Candida spp. из крови и других биожидкостей, субфебрилитет, потенциальный риск развития нефротоксичности, стабилизацию клинического состояния, амфотерицин В был отменен (общая длительность введения 38 дней). Произведена вторичная поздняя аутодермопластика на гранулирующие раны (третья по счету). Однако уже через 2 нед после отмены амфотерицина В появились многократные повторные высевы Candida spp. из крови. Введение амфотерицина В было возобновлено (курс на 20 дней). Произведена смена ЦВК. Продолжалась ВИВЛ. Была достигнута санация крови (многократные посевы на Candida spp. – отрицательные). Ребенок продолжал получать симптоматическую и антибактериальную (имипенем, ванкомицин, ципрофлоксацин) терапию, а также парентеральное питание. Через 3 нед после отмены амфотерицина В был отмечен рецидив кандидемии. В связи с развитием ИК, невозможностью вводить амфотерицин В (отмечена нефротоксичность) был назначен каспофунгин в расчете 50 мг/сут (общий курс введения 20 дней). Произведена смена ЦВК. Продолжалась ВИВЛ. С целью поиска очага инфекции провели ультразвуковое исследование печени, почек и селезенки, а также сердца. Очаговых изменений не выявлено. Изменений эндокарда, а также клапанов сердца не обнаружено. В удаленном ЦВК длительного стояния “Groshong” в просвете с внутренней поверхности в центральном отделе обнаружено небольшое количество прозрачного содержимого, которое было нанесено на стекла и окрашено по Павловскому. При микроскопии полученных мазков выявлялись скопления дрожжеподобных клеток и псевдомицелия Сandida spp. Наружный слой псевдомицелия и дрожжеподобных клеток выглядел в виде оптически прозрачной широкой зоны, которая соответствовала богатой полисахаридами оболочке гриба. Клетки Сandida spp. располагались плотно друг к другу, практически сливаясь, и были окружены широкой наружной полисахаридной оболочкой (рис. 1). Было проведено ультразвуковое исследование центральных вен с цветовым допплеровским сканированием. Обнаружены изменения стенок (тромбозы?) подвздошно-бедренных венозных сегментов с обеих сторон, многочисленные участки стенозов с сужением просвета сегментов вен до 0,2 см в местах предыдущего стояния ЦВК. Лечение каспофунгином было продолжено. Однако выделение C. albicans при посеве крови продолжалось. Несмотря на это на фоне приема антимикотика были проведены последующие оперативные вмешательства по вторичной аутодермопластике. Особенностью течения заболевания у данного ребенка c тяжелым обширным термическим поражением было то, что профилактическое применение флуконазола было неэффективным, развился ИК. Лечение амфотерицином В также было неэффективным: сохранялись клинические признаки генерализованной инфекции, при посеве крови многократно выделяли С. albicans, которая при этом была чувствительна in vitro к используемым антимикотикам. Причинами клинико-микологической неэффективности флуконазола и амфотерицина В, возможно, были биопленки Candida spp. Вероятным фактором риска развития кандидозной биопленки было постоянное парентеральное питание. Назначение каспофунгина в дозе 50 мг/сут позволило продолжить хирургическое лечение обширного термического поражения. Однако добиться полной санации ИК не удалось – сохранялась кандидемия и гипертермия. Вероятно, подобные кандидозные биопленки сохранялись на других поверхностях, в частности органических, таких как венозные сегменты в местах предыдущей постановки ЦВК. Анализ данных литературы В результате литературного поиска мы обнаружили 7229 публикаций, посвященных биопленкам. Из них 301 касалась кандидозных биопленок, из которых в 140 изучали эффективность различных противогрибковых средств на грибковые биопленки. Данные о механизмах формирования, метаболизме, фенотипах и клинической значимости грибковых биопленок крайне ограничены [5]. Большинство сообщений посвящены биопленкам C. albicans и C. parapsilosis. Факторы риска. К основным факторам риска развития кандидозных биопленок относят: ИК, вызванный C. albicans и C. parapsilosis; длительное применение ЦВК или мочевыводящего; эндопротезы; длительное парентеральное питание, прежде всего содержащее глюкозу. Основными группами риска являются пациенты хирургического профиля, длительно находящиеся в отделениях реанимации и интенсивной терапии [6, 7]. Есть данные, что кандидозные биопленки могут также образовываться не только на небиологических (к примеру, силиконовых), но и на биологических поверхностях [8]. Нет исследований, показывающих на основании многофакторного анализа статистическое значение перечисленных факторов риска в развитии кандидозных биопленок. Диагностика. Методы выявления биопленок сложны и зачастую недостаточно информативны. Возможным клиническим проявлением наличия кандидозной биопленки служит персистирующая кандидемия у пациента из группы высокого риска развития ИК на фоне применения ЦВК. Известны следующие лабораторные методы выявления кандидозных биопленок: парные количественные микробиологические исследования крови; посевы на питательные среды; обработка катетера ультразвуком; применение вибрации; взятие образцов биоматериала из просвета катетера щетками с последующим центрифугированием и окраской лейкоцитарного осадка акридиновым оранжевым [1]. В реальной клинической практике используют далеко не все из указанных методов, что создает ложное представление о низкой частоте данного биологического образования. Структура и состав. Состав кандидозных биопленок стали изучать с начала 2000-х годов. J.Chandra и соавт. (2001 г.) в исследованиях in vitro продемонстрировали, что формирование кандидозной биопленки проходит через три отличные друг от друга фазы. Эти фазы роста преобразовывают отдельные бластоспоры в четкие клеточные сообщества с матрицей из полисахарида, заключенные в кожух волокнистой структуры. С помощью флюоресцентной и лазерной микроскопии было показано, что гетерогенную архитектуру кандидозных биопленок составляют клеточные и внеклеточные элементы. Были выделены семь генов, которые кодируют белки адгезии Candida spp. [9]. Позднее были описаны следующие фазы формирования кандидозной биопленки: прилипания, межклеточного матричного производства и формирования зрелой биопленки, состоящей из мицелия и единичных клеток [10]. D. Kuhn и соавт. (2002 г.) на силиконовых моделях изучали биопленки, образованные С. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata и C. tropicalis. Сформированные биопленки визуализировали с помощью флюоресцентной и лазерной микроскопии. Было установлено, что биопленки C. albicans имели морфологию, отличную от других Candida spp. Биопленки состояли из слоя бластоспор с плотно лежащей матрицей, составленной из полисахаридов и гиф. Напротив, биопленки C. parapsilosis имели меньший объем, чем биопленки C. albicans, и состояли исключительно из собранных в группу бластоспор. Полученные данные свидетельствовали, что C. albicans производит количественно большую и структурно более сложную биопленку, чем другие Candida, в частности C. parapsilosis [11]. M. Al-Fattani и соавт. (2006 г.) изучали химический состав матрицы биопленок С.albicans и С.tropicalis. Обе матрицы содержали углевод, белок, гексосамин и фосфор. Однако главным компонентом в матрице C.albicans была глюкоза (32%), тогда как в матрице биопленок C. tropicalis – гексосамин (27%). Биопленки C. albicans были легче отделялись от пластмассовых поверхностей с помощью обработки ферментом литиказой (бета-1,3-глюканаза), чем C. tropicalis [12]. Изучение биопленок in vitro имеет целый ряд ограничений. В связи с этим D.Andes и соавт. (2004 г.) провели исследование на экспериментальных животных. Использовали центральную вену крыс, на которой изучали образование и структуру биопленок с помощью флюоресцентной и электронной микроскопии. Было показано, что в пространстве, смежном с поверхностью катетера, клетки Candida spp. плотно вложены во внеклеточную матрицу. Слой, смежный с катетером, был менее плотен. Наиболее удаленная поверхность биопленки содержала единичные клетки Candida spp., которые были вложены в волокнистый внеклеточный материал. Подобные особенности архитектоники биопленки Candida spp. характерны и для моделей in vitro. Однако электронная микроскопия показала наличие клеток экспериментального животного в составе матрицы кандидозной биопленки [13]. Чувствительность к антимикотикам. Особое значение для клинической практики имеет сниженная чувствительность к антимикотикам Candida spp. в составе биопленки [14; 15]. В настоящее время предложены стандартизированные методы определения in vitro чувствительности к антимикотикам Candida spp. в составе биопленки. В исследованиях установлено, что сессильные биопленки более устойчивы к антимикотикам, чем планктонные [16; 17]. В то же время, по целому ряду сообщений, новые антимикотики, такие как эхинокандины, активны в отношении C. albicans и C. parapsilosis, определяемых в биопленках. S.Bachmann и соавт. (2002 г.) сообщили об активности каспофунгина против биопленки C. albicans. Проведенные результаты показали, что каспофунгин затрагивает клеточную морфологию и метаболический статус биопленок. Установлено, что содержащее каспофунгин покрытие биоматериалов предотвращало последующее развитие биопленки C. albicans [18]. Авторы из США (2002 г.) in vitro определяли активность нистатина, флуконазола, хлоргексидина, тербинафина, амфотерицина В, вориконазола, равуконазола, липосомального амфотерицина В, липидного комплекса амфотерицина В, микофунгина и каспофунгина против кандидозных биопленок. Для оценки эффективности использовали лазерную микроскопию. Установлено, что традиционные антимикотики (нистатин, флуконазол, хлоргексидин, тербинафин, амфотерицин В), а также новые азолы (вориконазол и равуконазол) не влияли на биопленки. Напротив, липидные формы амфотерицина В (липосомальный и липидный комплекс) и эхинокандины (каспофунгин и микафунгин) показали высокую активность против кандидозных биопленок [19]. M. Al-Fattani и соавт. (2004 г.) изучали проникновение различных противогрибковых средств через биопленки грибов. В качестве модели исследования использовали дисковые фильтры. Было выявлено, что флуконазол проникал через биопленки всех разновидностей Candida более быстро, чем флюцитозин. При этом установлено, что проникновение флуконазола не сопровождалось полным разрушением биопленок. Эти результаты свидетельствуют, что одного проникновения антимикотиков через биопленки не достаточно. Были также исследованы смешанные биопленки, содержащие C. albicans и S. epidermidis. Изучали способность флюцитозина, флуконазола, амфотерицина В и вориконазола проникать через биопленки, содержащие C. albicans и S. epidermidis. Все антимикотики очень медленно проникали через эти смешанные биопленки. Однако концентрации антимикотиков, достигающие отдаленных от центра краев биопленки, всегда существенно превышали минимальную ингибирующую концентрацию для C. albicans. Авторы считают, что хотя присутствие бактерий и бактериального матричного материала задерживало распространение противогрибковых агентов, это не являлось причиной резистентности к ним C. albicans [20]. C. Cocuaud и соавт. (2005 г.) сообщали о противогрибковой активности каспофунгина против биопленок C. albicans и C. parapsilosis. Биопленки были произведены в пробирке, на катетерах силикона. Установлено, что использование терапевтической концентрации каспофунгина (2 мг/мл) значительно уменьшало метаболизм C. albicans и C. parapsilosis независимо от этапа созревания биопленки. При этом каспофунгин был активен против биопленок C. albicans, резистентных к флуконазолу [21]. Y. Samaranayake и соавт. (2005 г.) исследовали in vitro активность амфотерицина B, флуконазола и флюцитозина против биопленок, образованных C.albicans, C.parapsilosis, C.krusei. При электронной микроскопии установлено, что транспорту противогрибковых средств к Candida spp. больше всего препятствовала биопленка C.albicans по сравнению с C.parapsilosis и C.krusei. Амфотерицин B проникал через все биопленки хуже по сравнению с флуконазолом и флюцитозином. Однако амфотерицин В вызывал более выраженное повреждение поверхности биопленок по сравнению с другим антимикотиками [22]. J. Shuford и соавт. (2006 г.) in vivo изучали кандидозные биопленки на ЦВК у 48 кроликов. Кролики получали внутрь катетера амфотерицин В или каспофунгин в течение 7 дней. Культуры C.albicans были выделены у всех кроликов из группы контроля, у 3 получивших амфотерицин B, и ни у одного из получивших каспофунгин. Различия в количестве колоний C.albicans были обнаружены между контролем и амфотерицином (р<0,001), а также контролем и каспофунгином (р<0,001) [23]. Позднее J.Shuford и соавт. (2006 г.) изучали активность амфотерицина B, каспофунгина и вориконазола против сессильных и планктонных биопленок у 30 культур C.albicans, выделенных из крови. В результате было показано, что чувствительность к противогрибковым агентам уменьшилась, когда C.albicans был связан с биопленкой. При этом комбинация каспофунгина с вориконазолом не увеличивала активность по сравнению с пробами, когда каспофунгин был один [24]. M.Seidler и соавт. (2006 г.) in vitro изучали активность воздействия микафунгина на кандидозные биопленки C.albicans, C. parapsilosis, C.glabrata, C.tropicalis, C.dubliniensis, C.kefyr. Биопленки выделены на пенопласте и на фрагменте ЦВК. Установлено, что микафунгин активен против всех шести Candida spp. При этом микафунгин не уменьшал метаболическую деятельность кандидозных биопленок даже при самой высокой концентрации [25]. Выводы и рекомендации Кандидозные биопленки являются вероятной причиной персистирующей кандидемии. Возможны сочетанные грибково-бактериальные биопленки. Не известна частота развития кандидозных биопленок, что связано с достаточно сложной диагностикой данного явления. Не определены статистически значимые факторы риска развития биопленок Candida spp. Возбудители ИК в составе биопленок обладают высокой резистентностью к амфотерицину В, вориконазолу, флуконазолу и флюцитозину. Каспофунгин может быть активен против Candida spp. в составе биопленок. Однако не определена оптимальная доза каспофунгина и длительность его введения для лечения ИК, сопровождающегося развитием биопленки.

About the authors

M. A Brazol'

I. V Karabel'skaya

A. S Kolbin

S. D Popov

A. G Baindurashvili

N. N Klimko

References

Supplementary files