Sravnitel'nyy analiz oksidantnykh svoystv meropenemov(originala i generikov) in vitro

Full Text

Актуальность На сегодняшний день генерические препараты на фармацевтическом рынке РФ составляют 78–95%. Активные субстанции для производства лекарственных препаратов не менее чем в 90% – зарубежные [1]. Необязательность проверки фармацевтической и биологической эквивалентности препаратов на российском фармацевтическом рынке часто ставит под сомнение их биологическую аналогичность и терапевтическую эквивалентность [2]. Особую значимость имеет вопрос использования антибиотиков-генериков у пациентов, требующих интенсивной терапии. С одной стороны, использование неэквивалентных генерических антибиотиков приводит к активации бактериального процесса, формированию резистентности бактерий, вирусов и грибов к антимикробным препаратам, хронизации заболеваний, росту инвалидизации и смертности [3]. С другой стороны, работа врача без справочника «Orange Book» [4] с данными по группам биоэквивалентности препаратов, ограниченный выбор антибиотиковгенериков вызывают непредсказуемый лечебный эффект. Цель исследования Произвести сравнительную оценку биологического действия меропенемов (оригинала и генериков) путем оценки уровня конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) после инкубации препаратов с эритроцитами (in vitro) пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), используя реакцию оксидантного стресса (ОС). Задачи исследования Определить разницу в уровне конечных продуктов индуцированного перекисного окисления (ИПО) в реакциях эритроцитов пациентов и исследуемых меропенемов. Исследовать достоверность и направленность этих статистических различий. Выяснить возможную зависимость между уровнем индуцированного перекисного ответа меропенемов и степенью тяжести пациента по различным критериям. Оценить достоверность различий ИПО от тяжести состояния пациента и характера исследуемого меропенема. Материал и методы Методика исследования ПОЛ Изучение биологического эффекта антибиотиков проводили по уровню конечных продуктов перекисного окисления, образованных после инкубации с отмытыми эритроцитами пациента с последующей провоцированной в пробирке реакцией ОС. С помощью люминометра количественно оценивалась сопровождавшая химическую реакцию хемилюминесценция (ХЛ). Метод ХЛ достаточно давно используется для изучения реакций с участием радикалов [5–7]. Основа метода – измерение выделяемой энергии в виде квантов света при межрадикальном взаимодействии. Интенсивность свечения пропорциональна квадрату концентрации свободных радикалов в мембранах, а скорость перекисного окисления прямо пропорциональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность «сверхслабого» свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале, и измерение ХЛ довольно часто используется при изучении ПОЛ в различных объектах. Метод индуцирования ХЛ перекисью водорода с сульфатом железа основан на каталитическом разложении перекиси ионами металлов с переменной валентностью. Образующиеся при этом свободные радикалы выступают инициаторами свободнорадикального окисления (СРО). Радикал гидроксила чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу: путем окисления SH-групп мембранных белков c появлением дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий; непосредственным увеличением ионной проницаемости липидного бислоя для ионов водорода и кальция. Это приводит к потере митохондриями способности осуществлять синтез аденозинтрифосфата, и клетка оказывается в условиях энергетического голода. Рост в цитоплазме уровня ионов кальция приводит к повреждению клеточных структур; уменьшением электрической стабильности мембраны, снижением мембранного потенциала. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций [8]. В результате реакции рекомбинации перекисных радикалов образуются молекулярные продукты и выделяется квант света, который и определяет наблюдаемую ХЛ. Процесс СРО вызывает вспышку интенсивности ХЛ, которая в течение 30–60 с затухает в результате действия системы антиоксидантов, присутствующих в пробе. На интенсивность процесса ХЛ оказывают влияние естественные прои антиоксиданты. Препарат, введенный в исследуемую клеточную среду, в зависимости от принадлежности к проили антиоксидантам изменяет интенсивность ХЛ в сравнении с контролем. Графическая визуализация и расчет данных [9] производились в биохемилюминометре БХЛ-07 (рис. 1). Рис. 1 Типичная кинетика хемилюминесцентного сигнала. I max Интенсивность ХЛ, мВ I max*t S(t) t, с | www.consilium-medicum.com | CONSILIUM MEDICUM | ТОМ 13 | № 4 | 37 К л и н и ч е с к и е и с с л е д о в а н и я Таблица 1. Нозологии исследуемых пациентов Цирроз печени, кровотечение из варикозно расширенных вен пищевода, 6 Атеросклероз сосудов нижних конечностей, состояние после БАБШ 4 Вторичный бактериальный менингит 6 Протезирование нисходящего отдела аорты 2 Уросепсис 3 Вирусно-бактериальная пневмония 15 Острое нарушение мозгового кровообращения – ОНМК (ишемический инсульт) 13 Металлосинтез позвоночника при сколиозе 5 Политравма (ЧМТ, множественный перелом ребер, конечностей) 5 Аортокоронарное шунтирование 19 Хронический гепатит (HVC), начало интерферонотерапии 5 Кишечная непроходимость 7 Геморрагический панкреонекроз 7 Рак толстой кишки, гемиколонэктомия 6 ОНМК, постреанимационная болезнь 3 Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура 7 Тромбоэмболия легочной артерии, мелкие ветви 4 Таблица 2. Уровень критерия Колмогорова–Смирнова в оценке нормальности совокупной выборки S' N Макс. D К.–С. S'orig 117 0,163545 p<0,01 S'mrpbl 117 0,137741 p<0,05 S'spsr 117 0,130947 p<0,05 Графическое выражение равномерности распределения S' представлено на рис. 2. Рис. 2. Гистограмма распределения исследуемых величин S′orig, S′mrpbl, S′spsr. S′orig = 117*500*normal (x;210, 30774; 337, 4944) S′mrpbl = 117*500*normal (x;559, 7179; 504, 1173) Число наблюдений S′spsr = 117*500* normal (x; 752, 906; 578, 9526) S′orig S′mrpbl S′spsr Рис. 3. Диаграмма размаха S′ для исследуемых антибиотиков. Среднее Среднее±Ст. ош. Среднее±Ст. откл. Параметры ХЛ рассчитываются автоматически (S; Imax, Z = S/Imax., а=S/(Imax*t), Dec и т.д.) Исходя из работы in vitro с клеточной взвесью длительным периодом инкубации в качестве основного показателя ОС нами использована величина S (площадь под кривой интенсивности, или полная светосумма). Величина S (мВ/с) имеет прямую зависимость с концентрацией конечных продуктов ПОЛ в исследуемой среде. Последовательность лабораторного исследования была следующей: забранная гепаринизированная кровь пациента 3-кратно центрифугировалась (2000 об/мин, 15 мин) и отмывалась физиологическим раствором с удалением супернатанта. Эритроциты разбавляли в 5 раз (до Ht – 20%). Навески исследуемых антибиотиков по 10 мг разбавляли физиологическим раствором и добавляли в эритроцитарную взвесь. Конеч38 | CONSILIUM MEDICUM | ТОМ 13 | № 4 | www.consilium-medicum.com | ная концентрация антибиотика составляла 10 мкг/мл. Пробы ставились последовательно: контроль – исследуемые антибиотики. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Пробы в пробирках выдерживали в холодильнике (температура 4–6oС) в течение 18 ч. После согревания пробирок до комнатной температуры проводили провокационную химическую реакцию перекисного окисления биологического субстрата в пробирке [10]. Биохимическая основа реакции – провокация в биологической среде реакции Фентона: при добавлении к биологическому субстрату (100 мкг) в среде 2-замещенного фосфатного буфера (400 мкг) раствора двухвалентного железа (400 мкг) и перекиси водорода (100 мкг) происходит каталитическое разложение перекиси водорода ионами железа. При этом активные формы кислорода вступают в процесс инициирования СРО на уровне эритроцитарных мембран. Стабильность мембран эритроцитов определяется степенью эндотоксемии, м е м б р а н о с т а б и л и з и р у ю щ и м э ф ф е к т о м и с с л е дуемого антибиотика. Образующийся при распаде мембран неустойчивый тетроксид распадается с выделением кванта света. Активность свечения пропорциональна концентрации свободных радикалов RO2, соответствующих обрыву цепи свободнорадикального окисления. Величина S – суммарная величина свечения исследуемого субс т р а т а ( « п л о щ а д ь п о д к р и в о й » ) о п р е д е л я е т х а р актер влияния исследуемого антибиотика на эритроцитарные мембраны и фиксируется люминометром (БХЛ-07, Н. Новгород). Реакция регистрируется в течение 30 с. Показатели просчитываются на сопряженной компьютерной программе и выводятся в виде графика на монитор компьютера (С.В.Ермаков и соавт., 2000). Каждый показатель S представляет среднюю величину 3 исследований. В расчетах были использованы относительные величины S’, представляющие разность S исследуемого антибиотика и S контроля. Таким образом: S'orig=S orig-Sk; S'mrpbl=S mrpbl-Sk; S'spsr= SspsrSk. Характеристика больных Забор крови производился у пациентов, поступивших в ОРИТ. Исследуемые пациенты – 117 человек, из них мужчин – 84, средний возраст 55,62±16,8 года с различными нозологиями (табл. 1). Для выполнения задач исследования дополнительно в статистическую обработку включены лабораторные данные пациентов: уровень лейкоцитов (Ле), лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ, формула Я.Я.Кальф-Калифа), оценка состояния больного в баллах по шкалам (SOFA, Glasgo, SAPS II). Средние показатели по выбранным параметрам были следующие: Ле=13,07±4,17, ЛИИ=8,85±5,67, SOFA=4,56±3,22, Glasgo=12,89±2,1, SAPS II=40,74±16,45. Дизайн исследования Проведенная работа представляет собой лабораторное слепое ретроспективное контролируемое исследование. Исследование ПОЛ проводилось in vitro. Слепой характер исследования состоял в цифровом обозначении антибиотика в течение этапов лабораторного, статистического исследований. Международные названия исследуемых препаратов получали при оформлении результатов. Рандомизация пациентов для забора крови осуществлялась в случайном порядке без необходимости назначения карбапенемов по клиническим показаниям, до назначения каких-либо антибиотиков. В качестве исследуемого материала использовалась отмытые эритроциты пациентов, поступивших в ОРИТ. Исследовались антибиотики широкого спектра действия | www.consilium-medicum.com | CONSILIUM MEDICUM | ТОМ 13 | № 4 К л и н и ч е с к и е и с с л е д о в а н и я Таблица 3. Результаты сравнения средних S'orig, S'mrpbl, S'spsr по критерию t для связанных выборок Среднее Стд. от. N Разн. Стд. от. t S'orig 210,30 337,49 S'mrpbl 559,71 504,11 117 -349,410 310,048 -12,189 S'orig 210,30 337,49 S'spsr 752,90 578,95 117 -542,598 404,075 -14,524 Таблица 4. Корреляция Пирсона между выбранными критериями тяжести и S' меропенемов Корреляции (исходные относительные sta). Отмеченные корреляции значимы на уровне p SAPS II Glasgo SOFA Le Kalf-Kalif S'orig 0,11 -0,48* 0,20* 0,06 0,14 S'mrpbl -0,01 -0,46* 0,20* 0,19* 0,18 S'spsr -0,08 -0,41* 0,13 0,14 0,23* *Уровень достоверности р<0,05. Рис. 4. График зависимости S′ в cоответствии с оценкой пациента по шкале Glasgo. (среднее; отрезки: среднее±0,95 дов. интервал) Glasgo S′orig S′mrpbl S′spsr с бактерицидным эффектом – меропенемы (оригинал и генерики), наиболее часто используемые в отделении: МЕРОНЕМ, AstraZeneca (orig); МЕРОПЕНАБОЛ®, ООО Аболмед (mrpbl); МЕРОПЕНЕМ СПЕНСЕР, Cooper Pharma (spsr). Методика статистической обработки данных Последовательность проведенного нами анализа была следующей: оценка данных описательной статистики, проверка данных на нормальность распределения, выбор критериев для корреляционного или иного вида анализа, получение и описание достоверных результатов (p<0,05). Статистические расчеты, построение графиков и диаграмм производили с помощью Statistica 6,5 в среде Windows XP. Результаты исследований Относительные величины S'(S'orig, S'mrpbl, S'spsr) имели нормальное распределение (критерий Колмогорова–Смирнова, соответственно: р<0,01; <0,05; <0,05), определяя полноценную выборку переменных (рис. 2, табл. 2). Дополнительный тест подтверждения распределения – уровень критерия Левена в сравнении дисперсий >0,05 (соответственно 0,68; 0,75; 0,97). Уровень относительных средних величин S' для оригинала и исследуемых генериков, представленные на диаграмме размаха с учетом средних S', средней ошибки и стандартного отклонения, подтверждает значимую разницу в исследуемых величин (рис. 3). Количественную разницу со стандартным доверительным интервалом (p<0,05) мы подтвердили с высокой степенью вероятности (табл. 3) методом сравнения средних для связанных выборок по t-критерию: S'spsr> S'mrpbl>S'orig. Разница исследуемых величин S' достаточно высока: S'spsr / S'orig=3,58, S'mrpbl / S'orig=2,66. Расчетные данные подтверждают значительную разницу S' между оригиналом и генериками, что определяет значительный прооксидантный эффект исследуемых генериков и отсутствие биоэквивалентности с оригиналом. Использование линейной множественной регрессионной модели позволило определить предсказанную зависимую переменную по уровню стандартизованных регрессионных коэффициентов: S'orig & S'mrpbl, Beta=0,799, S'orig & S'spsr, Beta=0,423. Таким образом, orig & mrpbl имеют однонаправленные тесные изменения, а сравнительный антиоксидантный эффект orig & spsr весьма условный. Корреляция изначально выбранных критериев тяжести пациентов и уровня индуцированного перекисного ответа S′ in vitro была рассчитана (табл. 4) в виде коэффициентов корреляции Пирсона. Найденная связь умеренная отрицательная, касается только балльной оценки пациента по шкале Glasgo и носит убывающий характер в схеме S'origS'mrpblS'spsr. Сравнение динамики величин S' исследуемых меропенемов от уровня балльной оценки пациента по Glasgo (рис. 4) показывает сходный характер кривых с достоверной разной площадью под каждой кривой, рост значений S' максимально до уровня 6 баллов по шкале Glasgo с последующим падением ее уровня. Особенность графика S'orig – минимальная площадь под кривой, пересечение с изолинией на интервале Glasgo 9,5–10,5 баллов для orig, что определяет его «мембраностабилизирующий интервал». Выводы Исследование сравнительной оксидантной активности меропенемов (оригинала и генериков) методом ХЛ in vitro в среде отмытых эритроцитов выявило достоверную разницу в концентрации конечных продуктов перекисного окисления, определяя таким образом отсутствие биоэквивалентности оригинала и генериков. Уровень конечных продуктов перекисного окисления при провокации оксидантного стресса увеличивается в последовательности МЕРОНЕМ (AstraZeneca)→МЕРОПЕНАБОЛ® (ООО Аболмед)→ МЕРОПЕНЕМ СПЕНСЕР(Cooper Pharma). К л и н и ч е с к и е и с с л е д о в а н и я Направленность и выявленная зависимость orig & spsr позволили сделать вывод о выраженном прооксидантном эффекте препарата МЕРОПЕНЕМ СПЕНСЕР, Cooper Pharma. Из выбранных критериев тяжести пациента оксидантная активность исследуемых меропенемов имеет умеренную связь с оценкой пациента по шкале Glasgo. Индуцированный перекисный ответ имеет тенденцию к росту в связи со снижением балльной оценки пациента по шкале Glasgo с 10 до 6. Уровень конечных продуктов перекисного окисления при этом достоверно увеличивается в направлении: МЕРОНЕМ (AstraZeneca) → МЕРОПЕНАБОЛ® (ООО Аболмед)→МЕРОПЕНЕМ СПЕНСЕР(Cooper Pharma). МЕРОНЕМ (AstraZeneca) обладает мембраностабилизирующим эффектом в интервале шкалы Glasgo 9,5–10,5 баллов. Сравнение оксидантной активности лекарственных препаратов в числе генерических с помощью ХЛ является современным достаточно быстрым и информативным методом исследования.

About the authors

Yu. L Ketsko

I. G Trukhanova

O. A Gusyakova

References

Supplementary files