Ultrasonic treatment and application of collagen in the treatment of experimental chronic osteomyelitis

Full Text

Введение Актуальность проблемы остеомиелита определяется тяжестью его течения, стойкой нетрудоспособностью и высоким процентом инвалидизации пациентов - до 75%, вероятностью рецидивов заболевания - до 30% [1-3]. Заболеваемость остеомиелитом постоянно растет, что связано с неуклонным увеличением числа различных аварий, неспокойной политической обстановкой в мире, ростом наркозависимых пациентов, заболеваний сахарным диабетом и т.д. [4, 5]. Лечение остеомиелита основано на комплексном подходе, включающем активную хирургическую санацию остеомиелитического очага с применением антибактериальных препаратов [6, 7]. Но процесс лечения многократно усложняется при наличии антибиотикорезистентных штаммов возбудителей, чрезмерной аллергизации пациентов к противомикробным препаратам [8, 9]. Большую эффективность демонстрируют новые технологии и подходы к лечению заболевания, в том числе направленные на повышение репаративных возможностей кости [10-13], использование естественных, биологически активных агентов [14], применение остеоиндуктивных и остеокондуктивных материалов, отвечающих современным требованиям [15, 16]. Особую актуальность приобретают вопросы разработки новых методов санации остеомиелитической полости, которые будут способствовать надежному удалению из костной раны детрита и микрофлоры, обеспечивая адекватную санацию гнойного очага и ускорение регенеративных изменений костных структур с помощью различных аппликационных препаратов. Целью нашего исследования явилась оценка эффективности разработанного нового метода лечения экспериментального хронического остеомиелита (ХО), основанного на применении ультразвуковой обработки (УЗО) и коллагена. Материалы и методы Экспериментальные исследования проведены на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО «ВГМУ им. Н.Н.Бурденко» на 210 белых крысах в 5 группах животных: 2 контрольных и 3 опытных. Группы состояли из 42 животных каждая. Во всех группах моделировали ХО. В 1-й контрольной группе исследовались животные с ХО, которым лечения не проводилось. Во 2-й контрольной и опытных группах производили предварительную хирургическую санацию очага (ХСО), заключающуюся в удалении гнойно-некротических масс и секвестров. В 1-й опытной группе однократно применяли УЗО в течение 5 мин со скоростью ирригационного потока 40 мл/мин, с частотой вибрации 27 kHz. Во 2-й опытной группе использовали коллаген до полного заполнения костной полости в объеме 0,3 г. В 3-й опытной группе применяли метод лечения, основанный на сочетании УЗО и введении в костную полость коллагена. При оценке течения и определении эффективности лечения ХО в экспериментальных группах на 7, 14, 28, 60, 90 и 120-е сутки проводилась оценка состояния животных, изучался клинический анализ крови (WBC, ESR), показатели антиоксидантной системы - АОС (малоновый диальдегид - МДА, 2,4-динитрофенилгидразин - ДНГФ, супероксиддисмутаза - СОД, тиол) и минерального обмена (кальций, магний, медь), проводились морфологические (окраски гематоксилин-эозином, импрегнация серебром по Футу, ШИК-реакция), морфометрические (Tb.Sp, BA-TA, Tb.Th) и рентгенологические методы. Результаты и обсуждение Оценка состояния животных. На 7-е сутки во всех группах животные адинамичны, аппетит снижен, отмечаются выпадение шерстяного покрова, двигательная активность, сопровождается хромотой. Локально - выраженный отек бедра, гиперемия в области раны, наличие свищей с гнойным отделяемым; при пальпации конечности выраженная болезненность. На 14 и 28-е сутки в контрольных группах все еще отмечается угнетение общего состояния, сниженный аппетит, шерстяной покров тусклый, ломкий, двигательная активность нарушена. Локальный статус не отличается от исследуемых животных на 7-е сутки, в 1-й контрольной группе выраженный отек, гиперемия кожных покровов, свищи до 4-5 мм с интенсивным гнойным отделяемым. Во 2-й контрольной группе наблюдалось заживление раны, но признаки воспаления сохраняются. В опытных группах - умеренная положительная динамика. На 60 и 90-е сутки в 1-й контрольной группе наблюдается прогрессирование признаков воспаления. В опытных группах на данный срок выявлено улучшение общего состояния животных. Двигательная активность все еще нарушена в 1-й опытной группе. Во 2 и 3-й опытных группах животные практически не реагировали на пальпацию. Свищей не наблюдалось. Общие и местные проявления заболевания нормализовались в 3-й опытной группе, где проводили сочетанное лечение животных путем применения УЗО и коллагена. К 120-м суткам у исследуемых животных отмечен нормальный аппетит, восстановлена двигательная активность, хромоты, свищей, отека и гиперемии не выявлено. Результаты клинического анализа крови. При изучении клинического анализа крови динамика лейкоцитов (WBC) в контрольных группах имеет тенденцию к снижению, но даже к 90 и 120-м суткам сохраняется выраженный лейкоцитоз - 11,6±0,2×109/л и 10,4±0,5×109/л. При проведенном лечении в 1 и 2-й опытных группах лейкоцитоз снизился до 7,3±0,2×109/л и 7,0±0,3×109/л соответственно. В 3-й опытной группе нормальные показатели прослеживаются начиная с 28-х суток - 6,5±0,1×109/л (рис. 1). Уровень СОЭ (ESR) имеет тенденцию к снижению. Ускоренные значения выявлены на 7 и 14-е сутки в контрольных группах, в которых максимальное значение не превышало 11,0±0,7 мм/ч. Минимальные уровни СОЭ отмечаются во 2-й опытной группе на 90 и 120-е сутки - 1,8±0,1 и 1,6±0,1 мм/ч. В 3-й опытной группе нормальные показатели отмечаются с 28-х суток исследования и не превышают 1,6±0,1 мм/ч (рис. 2). На фоне длительно текущего воспалительного процесса в 1-й контрольной группе признаки интоксикации прогрессировали. Во 2-й контрольной группе имелась небольшая положительная динамика. В опытных группах на фоне проводимого лечения отмечалась выраженная тенденция к нормализации показателей. Наиболее благоприятное течение ХО отмечалось в 3-й опытной группе, где использовали УЗО и коллаген. Результаты АОС. При проведении сравнительного анализа АОС были получены следующие данные. При анализе уровня МДА в 1 и 2-й контрольных группах наблюдается высокое содержание показателя. Максимальные значения отмечены на 7-е сутки - 20,3±1,8 и 29,7±1,0 нмоль/мл соответственно. В 1-й опытной группе фиксировалась нестабильность значений, сохранялось высокое значение на 28-е сутки - 22,8±0,1 нмоль/мл. Во 2 и 3-й опытных группах показатели постепенно выравниваются, результаты не превышают уровня нормальных значений. Выраженная положительная динамика наблюдалась в группе с использованием комплексного лечения УЗО и синтезированного гидролизата коллагена. Высокие уровни ДНГФ отмечены в 1 и 2-й контрольных группах на все экспериментальные сроки, которые к 120-м суткам составили 70,4±0,5 и 59,4±0,4 нмоль/мл соответственно. В опытных группах выявлено достоверное снижение показателя. На 120-е сутки в 1-й опытной - до 37,7±0,15 нмоль/мл, 2-й опытной - до 39,0±0,1 нмоль/мл, 3-й опытной группе - до 40,2±0,3 нмоль/мл, что приближено к нормальным показателям. При оценке результатов СОД в контрольных группах выявлены более низкие показатели, которые не превышали 0,7±0,1 и 0,6±0,06 Ед/мл. В 1-й контрольной группе наблюдался дисбаланс равновесия показателей. Во 2 и 3-й опытных группах содержание СОД в крови животных постепенно выравнивалось, это свидетельствовало об уравновешивании АОС. Уровень тиола во все сроки наблюдения в контрольных и опытных группах превышал показатели интактных животных, что свидетельствует о продолжающейся активности АОС (табл. 1). Подавление АОС и высокая активность свободнорадикальных процессов привели к активации окислительного стресса. В контрольных группах при исследовании выявлены снижение резервных возможностей АОС и усиление интоксикации. В опытных группах на фоне проводимого лечения происходила нормализация окислительного стресса. Результаты минерального обмена. При изучении минерального обмена в 1-й контрольной группе выявлено постепенное увеличение уровня кальция. На 7-е сутки - 2,7±0,1 ммоль/л, к 120-м суткам эти значения составили 4,0±0,4 ммоль/л (гиперкальциемия). Во 2-й контрольной группе наблюдалась обратная картина, к 120-м суткам значение составило 1,1±0,08 ммоль/л (гипокальциемия). В опытных группах уровень Са постепенно выровнялся - 2,8±0,04, 2,9±0,03, 1,9±0,07 ммоль/л (рис. 3). При сравнительной оценке магния отмечается гипермагниемия во всех экспериментальных группах. Максимальные значения в 1-й контрольной группе на 28-е сутки - 2,12±0,2 ммоль/л. В 3-й опытной группе у животных с комплексным лечением на 60, 90 и 120-е сутки значения составили - 1,3±0,01, 1,0±0,06 и 1,4±0,04 ммоль/л соответственно, что свидетельствует о восстановлении уровня магния в крови животных (рис. 4). При исследовании уровня меди в плазме крови во всех группах наблюдалось низкое содержание элемента. В 1-й контрольной группе на 7-е сутки значение составляло 0,04±0,01 ммоль/л, а к 120-м - 0,03±0,01 ммоль/л. Во 2-й контрольной группе на 7-е сутки исследования - 0,03±0,01 ммоль/л, к 120-м - 0,06±0,02 ммоль/л. В 1-й опытной группе на 7-е сутки - 0,07±0,002 ммоль/л, 120-е - 0,05±0,002 ммоль/л. Во 2-й опытной группе уровень магния достиг 0,07±0,004 ммоль/л, а на 120-е сутки соответствовал нормальным показателям - 0,80±0,05 ммоль/л. В 3-й опытной группе на 7-е сутки наблюдалось значение 0,07±0,003 ммоль/л, на 120-е сутки это значение достигло 0,8±0,08 ммоль/л. В ходе исследования минерального обмена у экспериментальных животных выявлены гипокальциемия, гипермагниемия и гипокупремия. Уровень кальция в контрольных группах повышен, что свидетельствует о разрушении костной структуры и высвобождении элемента в кровь и дальнейшем его выведении из организма. В опытных группах динамика кальция свидетельствует об активном процессе резорбции костной структуры и в последующем ее остеогенезе. При оценке результатов наблюдали гипокупремию в контрольных и 1-й опытной группе, но во 2 и 3-й опытных группах на отдаленные сроки показатели соответствовали нормальным, что свидетельствует об активном процессе восстановления костной структуры у экспериментальных животных с ХО после проведенного лечения. Результаты рентгенологического исследования. При проведении данного исследования в 1-й контрольной группе на все исследуемые сроки рентгенологическая картина характеризовалась образованием секвестральной коробки, тотального секвестра, выраженными деструкциями, очагами остеосклероза и остеопороза. Во 2-й контрольной группе на отдаленные сроки преобладают реактивные процессы над костномозговым каналом, что приводит к заращению его костной тканью и на уровне поражения вовсе не дифференцируется. Происходит эбурнеация. В 1-й опытной группе изменения наблюдаются с 60-х суток. Видны пятнистые просветления кости, появление и прорастание реактивного остеосклероза, окаймляющего очаги деструкции и секвестрации. К 120-м суткам наблюдается исчезновение сетчатого рисунка, утолщение коркового слоя изнутри (эностоз), признаки периостальной и эндостальной костной мозоли. Увеличилась тень неассимилированного периостального остеофита, секвестров и некрозов костных структур не наблюдается. Во 2-й опытной группе на 28, 60, 90-е сутки выявлены признаки редукции периостальной и эндостальной мозоли и преобразование ее в интермедиарную мозоль. Костномозговой канал прослеживается четко. К 120-м суткам костно-балочная система просматривается более четко, появляются нормальные гладкие контуры кости, в области диафиза фиксируется интенсивная слившаяся с корковым слоем тень ассимилированного периостального остеофита. В 3-й опытной группе к 120-м суткам бедренная кость лабораторных животных имела четкий рисунок и хорошо выраженные границы кортикального слоя. Дефект был полностью заполнен новообразованной костной тканью. В результате рентгенологического исследования наиболее выраженная положительная динамика наблюдалась у животных 3-й опытной группы (где использовался метод лечения, основанный на применении УЗО и коллагена) в виде уменьшения зон остеопороза и остеосклероза. Прослеживаются четкие границы кортикального слоя, отсутствуют секвестры. Костные дефекты заполняются новообразованной структурой. Результаты морфологического исследования. На 7-е сутки в 1-й контрольной группе наблюдается диффузный воспалительный процесс в метаэпифизе. Выявлена массивная резорбция кости в очагах воспаления с резким истончением, а местами исчезновением комплексов костных балок и расширением гаверсовых каналов. Во 2-й контрольной группе выраженных морфологических отличий по сравнению с 1-й контрольной не наблюдалось. В 1-й опытной группе видны единичные остеобласты. Вокруг зоны деструкции образуются грануляционная ткань, ретикулиновые волокна. Во 2-й опытной группе наблюдаются рассасывание костной ткани и секвестрация отдельных участков. Отмечается выраженная рарефикация. В 3-й опытной группе компактная пластинка утолщена. Выявлен активный процесс эбурнеации, параллельно с которой идет рарефикация пораженной кости (рис. 5, 6). На 14-е сутки в 1-й контрольной группе определяются обширный некроз костных балок и более выраженное рассасывание кости на границе с очагом воспаления. На границе гнойника с компактной пластинкой отмечаются воспалительная инфильтрация, тромбоз сосудов. Появляются костные секвестры. Во 2-й контрольной группе начинаются пролиферация остеобластов, образование эндостальной и периостальной костной мозоли. В 1-й опытной группе сохраняются некротизированные участки костных структур с секвестрами. Фиксируются признаки эндохондрального и периостального окостенения, частичная деструкция хрящевого компонента, разрастание хряща с формированием слоистых структур. Формируется костная мозоль. Во 2-й опытной группе - интенсивное образование грануляционной ткани из неостеогенной стромы костного мозга, из которой формируется волокнистая соединительная ткань. В 3-й опытной группе костномозговая полость практически полностью облитерирована. Наблюдается разрастание грануляционной ткани на фоне сохраняющегося воспаления. Прослеживаются участки эндостального костеобразования в виде костных перекладин (рис. 7, 8). На 28-е сутки в 1-й контрольной группе происходит интенсивное рассасывание костной ткани. Появляется отграничение очага нагноения с оболочкой и продолжаются явления секвестрации, распространяются нагноения на периост, прогрессирует рарефикация кости вокруг очагов нагноения. На поверхности компактного слоя видна секвестральная борозда, происходят расширение и слияние гаверсовых каналов, костные балки исчезают. Во 2-й контрольной группе балки утолщены, гаверсовы каналы расширены, воспалительная инфильтрация сохраняется. Образуется умеренное количество ретикулярных и коллагеновых волокон. В 1-й опытной группе в костной ткани выявлены выраженные дистрофические изменения. Формируются костные трабекулы. Продолжается образование коллагеновых волокон и хрящевой ткани. Во 2-й опытной группе соединительная ткань резорбируется с восстановлением нормальной структуры костного мозга. Происходит медленное заполнение патологического очага остеогенной тканью. В 3-й опытной группе отмечается активный ангиогенез. Мелкие капилляры прорастают хрящевую ткань и способствуют ее замещению на костную (рис. 9, 10). На 60-е сутки в 1-й контрольной группе наблюдаются секвестры с резорбцией на поверхности и в толще. Образуются единичные свищевые ходы. Во 2-й контрольной группе дальнейшее снижение воспалительной инфильтрации в зоне остеомиелитического очага. Видны новые костные балки разной степени зрелости, секвестры. Отмечается расширение зоны остеогенеза. В эти сроки определяется хрящевая мозоль с четким градиентом от фиброзной ткани. В 1-й опытной группе явления дистрофических изменений сохраняются без выраженной воспалительной инфильтрации. Структура костного мозга сохраняется, со стороны эндоста в зоне остеомиелитического очага прослеживаются секвестры. Во вновь образованных костных балках видны участки хрящевой ткани. Формируется фиброз. Во 2-й опытной группе участков некроза нет. Остеомиелитический очаг заполняется молодой костной тканью. В 3-й опытной группе секвестров не наблюдается. Воспалительная инфильтрация отсутствует. Компактная пластина уплотнена. Прослеживается зрелая соединительная ткань (рис. 11, 12). На 90-е сутки в 1-й контрольной группе процессы рассасывания наблюдаются во всей пораженной кости, в зоне секвестрации выражено в максимальной степени. Во 2-й контрольной группе видны участки рыхлой неоформленной соединительной и ретикулофиброзной костных тканей. В отдельных участках ретикулофиброзная ткань замещается на пластинчатую. Костные балки частично фрагментированы. Встречаются единичные остеоциты. В 1-й опытной группе наблюдается очаговое замещение костного мозга грануляционной тканью. Фиксируются репарация кости со стороны эндоста и наличие остеобластов. Во 2-й опытной группе в области секвестрации костной ткани происходит заполнение дефектов грануляционной тканью, содержащей остеокласты. В 3-й опытной группе видны выраженный фиброз, большое количество расширенных кровеносных сосудов, новообразованная костная ткань с участками разрыхления. Завершается моделирование губчатой костной ткани (рис. 13, 14). На 120-е сутки в 1-й контрольной группе секвестры образуются из кости, подвергшейся эбурнеации, которая проявляется резким повышением плотности кости с потерей дифференцировки на компактное и губчатое вещество и не визуализируемой костномозговой полостью, а также выраженным склерозом гаверсовых каналов. Во 2-й контрольной группе внутренняя поверхность секвестральных капсул выстлана грануляциями. Наиболее выраженное костеобразование происходит в периосте и костномозговом канале. Периостальный остеогенез ведет к более резкому утолщению и деформации кости. В 1-й опытной группе происходит прорастание капилляров в зоне остеомиелитического очага, видны остеобласты, хондробласты, промежуточная остеоидная ткань. Наблюдаются процессы прямого остеосинтеза. Во 2-й опытной группе на месте остеомиелитического очага сформирована консолидированная костная мозоль. В 3-й опытной группе завершается процесс репарации костной структуры (рис. 15, 16). Таким образом, при проведении морфологического исследования на 90, 120-е сутки во всех опытных группах наблюдаются выраженные репаративные процессы. В 3-й опытной группе происходят ускорение синтеза коллагена, образование грануляционной ткани, улучшение микроциркуляции, а также рассасывание инфильтрации и усиление репаративных процессов. Результаты морфометрического исследования. Наибольшие показатели межтрабекулярного расстояния (Tb.Sp) выявлены в контрольных группах на 7-е сутки исследования - 331,1±7,9 и 328,2±2,8 μm. В 3-й опытной группе значения достигли минимального уровня - 321,9±3,1 μm. На 14-е сутки максимальные уровни остаются в 1 и 2-й контрольных группах - 328,6±3,7 и 327,3±1,3 μm. Минимальное значение в 3-й опытной группе - 320,5±4,5 μm. На 28-е сутки в 1 и 2-й контрольных группах показатели составили - 328,3±4,0 и 325,8±2,4 μm. В 1-й опытной группе - 324,9±2,2 μm. Во 2-й опытной группе - 322,0±1,009 μm. В 3-й опытной группе показатель уменьшился до 318,6±4,9 μm. На 60-е сутки в 1-й контрольной и 2-й опытной группах наблюдалось незначительное увеличение значений - 328,7±3,9 и 322,0±0,8 μm. Во 2-й контрольной, 1, 3-й опытных группах показатели снижались до 324,9±2,4 и 316,7±3,5 μm. На 90-е сутки минимальное значение выявлено в 3-й опытной группе - 316,8±3,6 μm. К 120-м суткам - 316,7±3,2 μm. При изучении показателей фракции костного участка (ВА-ТА) на 7-е сутки в 1 и 2-й контрольных группах показатели составили - 22,4±1,2 и 22,4±0,2%. Максимальный показатель выявлен в 3-й опытной группе - 35,3±1,3%. На 14-е сутки между контрольными и 1, 2-й опытными группами наблюдались минимальные различия. В 3-й опытной группе показатель составил 39,5±1,7%. На 28-е сутки прослеживаются увеличение значений в 1 и 2-й контрольных группах - 27,4±1,2 и 32,5±3,9%, выраженный подъем в 3-й опытной группе - 45,5±3,6%. На 60-е сутки максимальное значение остается в 3-й опытной группе - 47,0±4,2%. На 90-е сутки исследования показатели во всех группах продолжают увеличиваться. На 120-е сутки в 1 и 2-й контрольных группах наблюдается незначительное снижение - 30,4±0,2 и 33,7±3,6%. В опытных группах тенденция к увеличению остается, максимальное значение сохраняется в 3-й опытной группе - 48,2±3,8%. При исследовании средней толщины трабекул (Тb.Th) на 7-е сутки минимальные значения наблюдались в контрольных группах - 107,8±0,9 и 108,9±0,5 μm. В опытных группах постепенно увеличивались и составили 109,4±0,8, 110,5±0,2 и 111,2±0,6 μm. На 14-е сутки выраженных изменений не наблюдалось, но максимальное значение остается в 3-й опытной группе - 111,4±0,6 μm. На 28-е сутки существенных отличий между контрольными и 1, 2-й опытными группами не выявлено, показатели не превышали значения - 110,7±0,2 μm. В 3-й опытной группе - 111,5±0,5 μm. На 60, 90 и 120-е сутки в контрольных и 1, 2-й опытных группах значения не превышали 111,3±0,5 μm. В 3-й опытной группе на 120-е сутки составило 137,5±6,3 μm (табл. 2). Таким образом, при проведении морфометрического исследования выявлены достоверные изменения показателей и скорости репаративных процессов в костной ткани. Уменьшение величины Tb.Sp, увеличение BA-TA, Tb.Th статистически достоверно указывают на большую скорость образования костной мозоли в 3-й опытной группе. Используемый метод позволил улучшить эффективность лечения ХО за счет увеличения регионарного кровотока, инициирующего благоприятные изменения в микроциркуляторном русле и адвентиции сосудов, что способствовало усилению ангиогенеза, за счет этого сократились сроки воспалительных и гнойно-деструктивных явлений. Наряду с этим ускорились синтез коллагена и образование грануляционной ткани, что, в свою очередь, усилило репаративные процессы костной ткани. Заключение Разработанный комплексный метод лечения ХО, основанный на применении УЗО и коллагена, к 120-м суткам позволяет нормализовать общее состояние животных, сократить сроки заживления дефектов. Показатели клинического анализа крови нормализуются, наблюдается сбалансированность окислительного стресса, показатели минерального обмена свидетельствуют об активном процессе резорбции костной структуры и в последующем ее остеогенезе. В результате рентгенологического исследования к последнему сроку наблюдения было выявлено уменьшение зон остеопороза и остеосклероза, прослеживаются четкие границы кортикального слоя, отсутствуют секвестры, и дефекты заполняются новообразованной костной тканью. При морфологическом исследовании фиксируются ускорение синтеза коллагена, образование грануляционной ткани, улучшение микроциркуляции, происходит рассасывание инфильтрации. Морфометрические результаты исследования свидетельствуют о возрастании обособленности кости и предотвращении рарефикации костных структур.

About the authors

A. A Glukhov

Voronezh State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

394036, Russian Federation, Voronezh, ul. Studencheskaia, d. 10

A. A Andreev

Voronezh State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

394036, Russian Federation, Voronezh, ul. Studencheskaia, d. 10

N. A Malkina

Voronezh State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: nat76620664@mail.ru
394036, Russian Federation, Voronezh, ul. Studencheskaia, d. 10

References

Supplementary files